Gracias por visitar Nature.com.La versión del navegador que está utilizando tiene soporte CSS limitado.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador actualizado (o deshabilite el Modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, presentaremos el sitio sin estilos ni JavaScript.
Los vectores genéticos para el tratamiento de la fibrosis quística pulmonar deben dirigirse a las vías respiratorias conductoras, ya que la transducción pulmonar periférica no tiene ningún efecto terapéutico.La eficiencia de la transducción viral está directamente relacionada con el tiempo de residencia del portador.Sin embargo, los fluidos de administración, como los portadores de genes, se difunden naturalmente hacia los alvéolos durante la inhalación, y las partículas terapéuticas de cualquier forma se eliminan rápidamente mediante transporte mucociliar.Ampliar el tiempo de residencia de los portadores de genes en el tracto respiratorio es importante, pero difícil de lograr.Las partículas magnéticas conjugadas con portadores que pueden dirigirse a la superficie del tracto respiratorio pueden mejorar la focalización regional.Debido a problemas con las imágenes in vivo, no se comprende bien el comportamiento de estas pequeñas partículas magnéticas en la superficie de las vías respiratorias en presencia de un campo magnético aplicado.El objetivo de este estudio fue utilizar imágenes de sincrotrón para visualizar in vivo el movimiento de una serie de partículas magnéticas en la tráquea de ratas anestesiadas con el fin de estudiar la dinámica y los patrones de comportamiento de partículas individuales y masivas in vivo.Luego también evaluamos si la administración de partículas magnéticas lentivirales en presencia de un campo magnético aumentaría la eficiencia de la transducción en la tráquea de la rata.Las imágenes de rayos X sincrotrón muestran el comportamiento de partículas magnéticas en campos magnéticos estacionarios y en movimiento in vitro e in vivo.Las partículas no pueden arrastrarse fácilmente a través de la superficie de las vías respiratorias vivas utilizando imanes, pero durante el transporte, los depósitos se concentran en el campo de visión, donde el campo magnético es más fuerte.La eficiencia de la transducción también se multiplicó por seis cuando se administraron partículas magnéticas lentivirales en presencia de un campo magnético.En conjunto, estos resultados sugieren que las partículas magnéticas lentivirales y los campos magnéticos pueden ser enfoques valiosos para mejorar la focalización de vectores genéticos y los niveles de transducción en las vías respiratorias conductoras in vivo.
La fibrosis quística (FQ) es causada por variaciones en un solo gen llamado regulador de conductancia transmembrana de la FQ (CFTR).La proteína CFTR es un canal iónico que está presente en muchas células epiteliales de todo el cuerpo, incluidas las vías respiratorias, un sitio importante en la patogénesis de la fibrosis quística.Los defectos en CFTR provocan un transporte anormal de agua, deshidratación de la superficie de las vías respiratorias y disminución de la profundidad de la capa de líquido de la superficie de las vías respiratorias (ASL).También afecta la capacidad del sistema de transporte mucociliar (MCT) para limpiar las vías respiratorias de partículas y patógenos inhalados.Nuestro objetivo es desarrollar una terapia génica lentiviral (LV) para administrar la copia correcta del gen CFTR y mejorar el ASL, el MCT y la salud pulmonar, y continuar desarrollando nuevas tecnologías que puedan medir estos parámetros in vivo1.
Los vectores LV son uno de los principales candidatos para la terapia génica de la fibrosis quística, principalmente porque pueden integrar permanentemente el gen terapéutico en las células basales de las vías respiratorias (células madre de las vías respiratorias).Esto es importante porque pueden restaurar la hidratación normal y la eliminación de moco al diferenciarse en células funcionales de la superficie de las vías respiratorias corregidas genéticamente asociadas con la fibrosis quística, lo que resulta en beneficios para toda la vida.Los vectores del VI deben dirigirse contra las vías respiratorias conductoras, ya que aquí es donde comienza la afectación pulmonar en la FQ.La administración del vector a una profundidad más profunda del pulmón puede dar lugar a una transducción alveolar, pero esto no tiene ningún efecto terapéutico en la fibrosis quística.Sin embargo, los fluidos, como los portadores de genes, migran naturalmente a los alvéolos cuando se inhalan después del parto3,4 y los MCT expulsan rápidamente las partículas terapéuticas a la cavidad bucal.La eficiencia de la transducción del VI está directamente relacionada con el período de tiempo que el vector permanece cerca de las células diana para permitir la absorción celular: "tiempo de residencia" 5 que se acorta fácilmente mediante el flujo de aire regional típico, así como la absorción coordinada de moco y partículas de MCT.Para la fibrosis quística, la capacidad de prolongar el tiempo de residencia del VI en las vías respiratorias es importante para lograr altos niveles de transducción en esta área, pero hasta ahora ha sido un desafío.
Para superar este obstáculo, proponemos que las partículas magnéticas (MP) de BT puedan ayudar de dos formas complementarias.En primer lugar, pueden ser guiados por un imán hacia la superficie de las vías respiratorias para mejorar la orientación y ayudar a que las partículas portadoras de genes estén en el área correcta de las vías respiratorias;y ASL) pasan a la capa celular 6. Las MP se utilizan ampliamente como vehículos de administración de fármacos dirigidos cuando se unen a anticuerpos, fármacos de quimioterapia u otras moléculas pequeñas que se adhieren a las membranas celulares o se unen a sus respectivos receptores de la superficie celular y se acumulan en los sitios tumorales en Presencia de electricidad estática.Campos magnéticos para la terapia del cáncer 7. Otros métodos “hipertérmicos” tienen como objetivo matar las células tumorales calentando MP cuando se exponen a campos magnéticos oscilantes.El principio de transfección magnética, en el que se utiliza un campo magnético como agente de transfección para mejorar la transferencia de ADN a las células, se utiliza comúnmente in vitro utilizando una variedad de vectores genéticos virales y no virales para líneas celulares difíciles de transducir. ..Se estableció la eficacia de la magnetotransfección del VI con la administración de MP del VI in vitro en una línea celular de epitelio bronquial humano en presencia de un campo magnético estático, aumentando la eficacia de la transducción 186 veces en comparación con el vector del VI solo.La MT del VI también se ha aplicado a un modelo in vitro de fibrosis quística, donde la transfección magnética aumentó la transducción del VI en cultivos de interfaz aire-líquido en un factor de 20 en presencia de esputo de fibrosis quística10.Sin embargo, la magnetotransfección de órganos in vivo ha recibido relativamente poca atención y solo se ha evaluado en unos pocos estudios en animales11,12,13,14,15, especialmente en los pulmones16,17.Sin embargo, las posibilidades de la transfección magnética en la terapia pulmonar de la fibrosis quística son claras.Tan et al.(2020) afirmaron que “un estudio de validación sobre la administración pulmonar eficaz de nanopartículas magnéticas allanará el camino para futuras estrategias de inhalación de CFTR para mejorar los resultados clínicos en pacientes con fibrosis quística”6.
El comportamiento de pequeñas partículas magnéticas en la superficie del tracto respiratorio en presencia de un campo magnético aplicado es difícil de visualizar y estudiar y, por lo tanto, no se comprende bien.En otros estudios, hemos desarrollado un método de imágenes de rayos X de contraste de fase basado en propagación de sincrotrón (PB-PCXI) para obtener imágenes no invasivas y cuantificar cambios diminutos in vivo en la profundidad de ASL18 y el comportamiento de MCT19,20 para medir directamente la hidratación de la superficie del canal de gas. y se utiliza como indicador temprano de la eficacia del tratamiento.Además, nuestro método de puntuación MCT utiliza partículas de 10 a 35 µm de diámetro compuestas de alúmina o vidrio de alto índice de refracción como marcadores MCT visibles con PB-PCXI21.Ambos métodos son adecuados para obtener imágenes de una variedad de tipos de partículas, incluidas las MP.
Debido a la alta resolución espacial y temporal, nuestros ensayos ASL y MCT basados ​​en PB-PCXI son muy adecuados para estudiar la dinámica y los patrones de comportamiento de partículas individuales y masivas in vivo para ayudarnos a comprender y optimizar los métodos de administración del gen MP.El enfoque que utilizamos aquí se basa en nuestros estudios utilizando la línea de luz SPring-8 BL20B2, en la que visualizamos el movimiento del fluido después de la administración de una dosis de un vector ficticio en las vías respiratorias nasales y pulmonares de ratones para ayudar a explicar los patrones heterogéneos de expresión genética observados. en nuestro gen.estudios en animales con una dosis portadora de 3,4 .
El objetivo de este estudio fue utilizar el sincrotrón PB-PCXI para visualizar los movimientos in vivo de una serie de MP en la tráquea de ratas vivas.Estos estudios de imágenes PB-PCXI se diseñaron para probar la serie MP, la intensidad del campo magnético y la ubicación para determinar su efecto sobre el movimiento del MP.Supusimos que un campo magnético externo ayudaría a que el MF emitido permaneciera o se moviera hacia el área objetivo.Estos estudios también nos permitieron determinar configuraciones de imanes que maximizan la cantidad de partículas que quedan en la tráquea después de la deposición.En una segunda serie de estudios, nuestro objetivo fue utilizar esta configuración óptima para demostrar el patrón de transducción resultante de la administración in vivo de LV-MP a las vías respiratorias de ratas, asumiendo que la administración de LV-MP en el contexto de la focalización en las vías respiratorias daría como resultado en una mayor eficiencia de transducción del VI..
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Adelaida (M-2019-060 y M-2020-022) y el Comité de Ética Animal del Sincrotrón SPring-8.Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de ARRIVE.
Todas las imágenes de rayos X se tomaron en la línea de luz BL20XU en el sincrotrón SPring-8 en Japón utilizando una configuración similar a la descrita anteriormente21,22.Brevemente, la caja experimental se ubicó a 245 m del anillo de almacenamiento del sincrotrón.Se utiliza una distancia entre la muestra y el detector de 0,6 m para estudios de imágenes de partículas y de 0,3 m para estudios de imágenes in vivo para crear efectos de contraste de fase.Se utilizó un haz monocromático con una energía de 25 keV.Las imágenes se adquirieron utilizando un transductor de rayos X de alta resolución (SPring-8 BM3) acoplado a un detector sCMOS.El transductor convierte los rayos X en luz visible utilizando un centelleador de 10 µm de espesor (Gd3Al2Ga3O12), que luego se dirige al sensor sCMOS utilizando un objetivo de microscopio ×10 (NA 0,3).El detector sCMOS era un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japón) con un tamaño de matriz de 2048 × 2048 píxeles y un tamaño de píxel sin procesar de 6,5 × 6,5 µm.Esta configuración proporciona un tamaño de píxel isotrópico efectivo de 0,51 µm y un campo de visión de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm.Se eligió la duración de exposición de 100 ms para maximizar la relación señal-ruido de las partículas magnéticas dentro y fuera de las vías respiratorias y al mismo tiempo minimizar los artefactos de movimiento causados ​​por la respiración.Para los estudios in vivo, se colocó un obturador de rayos X rápido en la trayectoria de los rayos X para limitar la dosis de radiación bloqueando el haz de rayos X entre exposiciones.
No se utilizó medio LV en ningún estudio de imágenes SPring-8 PB-PCXI porque la cámara de imágenes BL20XU no tiene certificación de nivel de bioseguridad 2.En su lugar, seleccionamos una gama de MP bien caracterizados de dos proveedores comerciales que cubren una variedad de tamaños, materiales, concentraciones de hierro y aplicaciones, primero para comprender cómo los campos magnéticos afectan el movimiento de los MP en los capilares de vidrio, y luego en vías respiratorias vivas.superficie.El tamaño del MP varía de 0,25 a 18 µm y está hecho de varios materiales (ver Tabla 1), pero se desconoce la composición de cada muestra, incluido el tamaño de las partículas magnéticas del MP.Según nuestros extensos estudios de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que se puedan ver MP de hasta 5 µm en la superficie de la vía aérea traqueal, por ejemplo, restando fotogramas consecutivos para ver una mejor visibilidad del movimiento de MP.Un solo MP de 0,25 µm es más pequeño que la resolución del dispositivo de imágenes, pero se espera que PB-PCXI detecte su contraste volumétrico y el movimiento de la superficie líquida sobre la que se depositan después de ser depositados.
Muestras para cada MP de la tabla.1 se preparó en capilares de vidrio de 20 µl (Drummond Microcaps, PA, EE. UU.) con un diámetro interno de 0,63 mm.Las partículas corpusculares están disponibles en agua, mientras que las partículas CombiMag están disponibles en el líquido patentado por el fabricante.Cada tubo se llena hasta la mitad con líquido (aproximadamente 11 µl) y se coloca en el soporte de muestra (consulte la Figura 1).Los capilares de vidrio se colocaron horizontalmente en el escenario de la cámara de imágenes, respectivamente, y se colocaron en los bordes del líquido.Se conectó a un imán de carcasa de níquel de 19 mm de diámetro (28 mm de largo) hecho de tierras raras, neodimio, hierro y boro (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una remanencia de 1,17 T. mesa de transferencia separada para lograr cambiar de forma remota su posición durante el renderizado.Las imágenes de rayos X comienzan cuando el imán se coloca aproximadamente a 30 mm por encima de la muestra y las imágenes se adquieren a 4 fotogramas por segundo.Durante la toma de imágenes, el imán se acercó al tubo capilar de vidrio (a una distancia de aproximadamente 1 mm) y luego se movió a lo largo del tubo para evaluar el efecto de la intensidad del campo y la posición.
Una configuración de imágenes in vitro que contiene muestras de MP en capilares de vidrio en la etapa de traducción de la muestra xy.La trayectoria del haz de rayos X está marcada con una línea de puntos roja.
Una vez que se estableció la visibilidad in vitro de las MP, se probó un subconjunto de ellas in vivo en ratas albinas Wistar hembra de tipo salvaje (~12 semanas de edad, ~200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japón), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japón) y butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Las ratas fueron anestesiadas con una mezcla de Pharma (Japón) mediante inyección intraperitoneal.Después de la anestesia, se los preparó para obtener imágenes quitando el pelaje alrededor de la tráquea, insertando un tubo endotraqueal (ET; cánula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e inmovilizándolos en posición supina en una placa de imágenes hecha a medida que contenía una bolsa térmica. para mantener la temperatura corporal.22. Luego se fijó la placa de imágenes a la platina de muestra en la caja de imágenes en un ligero ángulo para alinear la tráquea horizontalmente en la imagen de rayos X, como se muestra en la Figura 2a.
(a) Configuración de imágenes in vivo en la unidad de imágenes SPring-8, trayectoria del haz de rayos X marcada con una línea de puntos roja.(b,c) La localización del imán traqueal se realizó de forma remota utilizando dos cámaras IP montadas ortogonalmente.En el lado izquierdo de la imagen en la pantalla, puede ver el bucle de alambre que sujeta la cabeza y la cánula de administración instalada dentro del tubo ET.
Se conectó un sistema de bomba de jeringa con control remoto (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) que utilizaba una jeringa de vidrio de 100 µl a un tubo de PE10 (0,61 mm de diámetro exterior, 0,28 mm de diámetro interior) utilizando una aguja de calibre 30.Marque el tubo para asegurarse de que la punta esté en la posición correcta en la tráquea al insertar el tubo endotraqueal.Utilizando una microbomba, se retiró el émbolo de la jeringa y se sumergió la punta del tubo en la muestra MP que se iba a administrar.Luego se insertó el tubo de administración cargado en el tubo endotraqueal, colocando la punta en la parte más fuerte de nuestro campo magnético aplicado esperado.La adquisición de imágenes se controló mediante un detector de aliento conectado a nuestra caja de sincronización basada en Arduino, y todas las señales (p. ej., temperatura, respiración, apertura/cierre del obturador y adquisición de imágenes) se registraron utilizando Powerlab y LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia). 22 Al tomar imágenes Cuando la carcasa no estaba disponible, se colocaron dos cámaras IP (Panasonic BB-SC382) a aproximadamente 90° entre sí y se usaron para controlar la posición del imán en relación con la tráquea durante la toma de imágenes (Figura 2b, c).Para minimizar los artefactos de movimiento, se adquirió una imagen por respiración durante la meseta del flujo respiratorio terminal.
El imán está unido a la segunda etapa, que puede estar ubicada de forma remota en el exterior del cuerpo de imágenes.Se probaron varias posiciones y configuraciones del imán, entre ellas: colocado en un ángulo de aproximadamente 30° por encima de la tráquea (las configuraciones se muestran en las Figuras 2a y 3a);un imán encima del animal y el otro debajo, con los polos colocados para atraer (Figura 3b)., un imán encima del animal y otro debajo, con los polos configurados para la repulsión (Figura 3c), y un imán encima y perpendicular a la tráquea (Figura 3d).Después de configurar el animal y el imán y cargar el MP bajo prueba en la bomba de jeringa, administre una dosis de 50 l a una velocidad de 4 l/s tras la adquisición de imágenes.Luego, el imán se mueve hacia adelante y hacia atrás a lo largo o a través de la tráquea mientras continúa adquiriendo imágenes.
Configuración de imán para imágenes in vivo (a) un imán encima de la tráquea en un ángulo de aproximadamente 30°, (b) dos imanes configurados para atracción, (c) dos imanes configurados para repulsión, (d) un imán encima y perpendicular a la tráquea.El observador miró desde la boca hasta los pulmones a través de la tráquea y el haz de rayos X pasó por el lado izquierdo de la rata y salió por el lado derecho.El imán se mueve a lo largo de las vías respiratorias o hacia la izquierda y hacia la derecha por encima de la tráquea en la dirección del haz de rayos X.
También buscamos determinar la visibilidad y el comportamiento de las partículas en las vías respiratorias en ausencia de mezcla de respiración y frecuencia cardíaca.Por lo tanto, al final del período de obtención de imágenes, los animales fueron sacrificados humanamente debido a una sobredosis de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, EE. UU.; ~65 mg/kg ip).Algunos animales se dejaron en la plataforma de imágenes y, después del cese de la respiración y los latidos del corazón, se repitió el proceso de imágenes, agregando una dosis adicional de MP si no se veía MP en la superficie de las vías respiratorias.
Las imágenes resultantes se corrigieron para campo plano y oscuro y luego se ensamblaron en una película (20 fotogramas por segundo; 15–25 × velocidad normal dependiendo de la frecuencia respiratoria) utilizando un guión personalizado escrito en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos los estudios sobre la administración del vector del gen LV se realizaron en el Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Adelaide y tenían como objetivo utilizar los resultados del experimento SPring-8 para evaluar si la administración de LV-MP en presencia de un campo magnético podría mejorar la transferencia de genes in vivo. .Para evaluar los efectos de MF y el campo magnético, se trataron dos grupos de animales: a un grupo se le inyectó LV MF con colocación de imán y al otro grupo se le inyectó un grupo de control con LV MF sin imán.
Los vectores del gen LV se han generado utilizando métodos descritos previamente 25, 26.El vector LacZ expresa un gen de beta-galactosidasa localizado en el núcleo impulsado por el promotor constitutivo MPSV (LV-LacZ), que produce un producto de reacción azul en las células transducidas, visible en frentes y secciones de tejido pulmonar.La titulación se realizó en cultivos celulares contando manualmente el número de células positivas para LacZ usando un hemocitómetro para calcular el título en TU/ml.Los portadores se criopreservan a -80 °C, se descongelan antes de su uso y se unen a CombiMag mezclándolos 1:1 e incubando en hielo durante al menos 30 minutos antes de su entrega.
Ratas Sprague Dawley normales (n = 3/grupo, ~2-3 anestesiadas ip con una mezcla de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) y 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Australia) al mes de edad) ip ) inyección y canulación oral no quirúrgica con una cánula intravenosa de 16 Ga.Para garantizar que el tejido de las vías respiratorias traqueales reciba transducción del VI, se acondicionó utilizando nuestro protocolo de perturbación mecánica descrito anteriormente en el que la superficie de las vías respiratorias traqueales se frotó axialmente con una cesta de alambre (N-Circle, extractor de cálculos de nitinol sin punta NTSE-022115) -UDH. Cook Medical, EE. UU.) 30 p28.Luego, aproximadamente 10 minutos después de la perturbación en la cabina de bioseguridad, se realizó la administración traqueal de LV-MP.
El campo magnético utilizado en este experimento se configuró de manera similar a un estudio de rayos X in vivo, con los mismos imanes sostenidos sobre la tráquea con abrazaderas del stent de destilación (Figura 4).Se administró a la tráquea un volumen de 50 µl (2 alícuotas de 25 µl) de LV-MP (n = 3 animales) utilizando una pipeta con punta de gel como se describió anteriormente.El grupo de control (n = 3 animales) recibió el mismo LV-MP sin el uso de un imán.Una vez completada la infusión, se retira la cánula del tubo endotraqueal y se extuba al animal.El imán permanece en su lugar durante 10 minutos antes de retirarse.A las ratas se les administró por vía subcutánea meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguido de la retirada de la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 1 mg/kg de clorhidrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia).Las ratas se mantuvieron calientes y se observaron hasta su completa recuperación de la anestesia.
Dispositivo de administración LV-MP en una cabina de seguridad biológica.Puede ver que la funda Luer-lock gris claro del tubo ET sobresale de la boca y la punta de la pipeta de gel que se muestra en la figura se inserta a través del tubo ET hasta la profundidad deseada en la tráquea.
Una semana después del procedimiento de administración de LV-MP, los animales se sacrificaron humanamente mediante inhalación de CO2 al 100 % y se evaluó la expresión de LacZ utilizando nuestro tratamiento estándar con X-gal.Se retiraron los tres anillos de cartílago más caudales para garantizar que cualquier daño mecánico o retención de líquidos debido a la colocación del tubo endotraqueal no se incluyera en el análisis.Cada tráquea se cortó longitudinalmente para obtener dos mitades para el análisis y se colocó en una copa que contenía caucho de silicona (Sylgard, Dow Inc) usando una aguja Minutien (Fine Science Tools) para visualizar la superficie luminal.La distribución y el carácter de las células transducidas se confirmaron mediante fotografía frontal utilizando un microscopio Nikon (SMZ1500) con una cámara DigiLite y el software TCapture (Tucsen Photonics, China).Las imágenes se adquirieron con un aumento de 20x (incluida la configuración máxima para todo el ancho de la tráquea), y se mostró la longitud completa de la tráquea paso a paso, lo que proporcionó suficiente superposición entre cada imagen para permitir que las imágenes se "unieran".Luego, las imágenes de cada tráquea se combinaron en una única imagen compuesta utilizando Composite Image Editor versión 2.0.3 (Microsoft Research) utilizando el algoritmo de movimiento plano. El área de expresión de LacZ dentro de las imágenes compuestas traqueales de cada animal se cuantificó utilizando un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describió anteriormente28, utilizando configuraciones de 0,35 < Tono < 0,58, Saturación > 0,15 y Valor < 0,7. El área de expresión de LacZ dentro de las imágenes compuestas traqueales de cada animal se cuantificó utilizando un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describió anteriormente28, utilizando configuraciones de 0,35 < Tono < 0,58, Saturación > 0,15 y Valor < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием El escenario estándar de MATLAB (R2020a, MathWorks), como el de la versión 28, con una configuración de 0,35 <0,58, 0,15 y 0,15. ,7. El área de expresión de LacZ en imágenes traqueales compuestas de cada animal se cuantificó utilizando un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describió anteriormente28 usando configuraciones de 0,35.0,15 y valor<0,7.Aplicación de MATLAB (R2020a), MathWorks, aplicación LacZ量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 .................... CADERA Области экспрессии LacZ on составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием Nuevo estándar de MATLAB (R2020a, MathWorks), que es un panel de opciones con un valor predeterminado de 0,35 <0,58, un valor> 0,15 y un valor <0,7. . Las áreas de expresión de LacZ en imágenes compuestas de la tráquea de cada animal se cuantificaron utilizando un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describió anteriormente usando configuraciones de 0,35 < tono < 0,58, saturación > 0,15 y valor < 0,7.Al rastrear los contornos del tejido en GIMP v2.10.24, se creó manualmente una máscara para cada imagen compuesta para identificar el área del tejido y evitar detecciones falsas fuera del tejido traqueal.Las áreas teñidas de todas las imágenes compuestas de cada animal se sumaron para dar el área teñida total para ese animal.Luego se dividió el área pintada por el área total de la máscara para obtener un área normalizada.
Cada tráquea se embebió en parafina y se seccionó con un espesor de 5 µm.Las secciones se tiñeron con rojo neutro rápido durante 5 minutos y las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Nikon Eclipse E400, una cámara DS-Fi3 y un software de captura de elementos NIS (versión 5.20.00).
Todos los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).La significación estadística se fijó en p ≤ 0,05.La normalidad se probó mediante la prueba de Shapiro-Wilk y las diferencias en la tinción de LacZ se evaluaron mediante una prueba t no apareada.
Los seis MP descritos en la Tabla 1 fueron examinados por PCXI, y la visibilidad se describe en la Tabla 2. Dos MP de poliestireno (MP1 y MP2; 18 µm y 0,25 µm, respectivamente) no fueron visibles por PCXI, pero las muestras restantes pudieron identificarse. (Se muestran ejemplos en la Figura 5).MP3 y MP4 son débilmente visibles (10-15% Fe3O4; 0,25 µm y 0,9 µm, respectivamente).Aunque MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) contenía algunas de las partículas más pequeñas analizadas, fue la más pronunciada.El producto CombiMag MP6 es difícil de distinguir.En todos los casos, nuestra capacidad para detectar MF mejoró enormemente al mover el imán hacia adelante y hacia atrás en paralelo al capilar.A medida que los imanes se alejaban del capilar, las partículas se extraían en largas cadenas, pero a medida que los imanes se acercaban y la intensidad del campo magnético aumentaba, las cadenas de partículas se acortaban a medida que las partículas migraban hacia la superficie superior del capilar (consulte el vídeo complementario S1). : MP4), aumentando la densidad de partículas en la superficie.Por el contrario, cuando se retira el imán del capilar, la intensidad del campo disminuye y los MP se reorganizan en largas cadenas que se extienden desde la superficie superior del capilar (consulte el video complementario S2: MP4).Después de que el imán deja de moverse, las partículas continúan moviéndose durante algún tiempo después de alcanzar la posición de equilibrio.A medida que el MP se acerca y se aleja de la superficie superior del capilar, las partículas magnéticas tienden a atraer desechos a través del líquido.
La visibilidad de MP bajo PCXI varía considerablemente entre muestras.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 y (d) MP6.Todas las imágenes que se muestran aquí se tomaron con un imán colocado aproximadamente a 10 mm directamente encima del capilar.Los círculos grandes aparentes son burbujas de aire atrapadas en los capilares, que muestran claramente las características de los bordes en blanco y negro de la imagen de contraste de fases.El cuadro rojo indica la ampliación que mejora el contraste.Tenga en cuenta que los diámetros de los circuitos magnéticos en todas las figuras no están a escala y son aproximadamente 100 veces mayores que los que se muestran.
A medida que el imán se mueve hacia la izquierda y hacia la derecha a lo largo de la parte superior del capilar, el ángulo de la cuerda MP cambia para alinearse con el imán (ver Figura 6), delineando así las líneas del campo magnético.Para MP3-5, después de que la cuerda alcanza el ángulo umbral, las partículas se arrastran a lo largo de la superficie superior del capilar.Esto a menudo da como resultado que los MP se agrupen en grupos más grandes cerca de donde el campo magnético es más fuerte (consulte el video complementario S3: MP5).Esto también es especialmente evidente cuando se obtienen imágenes cerca del final del capilar, lo que hace que el MP se agregue y se concentre en la interfaz líquido-aire.Las partículas del MP6, que eran más difíciles de distinguir que las del MP3-5, no se arrastraron cuando el imán se movió a lo largo del capilar, pero las cuerdas del MP se disociaron, dejando las partículas a la vista (consulte el vídeo complementario S4: MP6).En algunos casos, cuando el campo magnético aplicado se redujo moviendo el imán a una gran distancia del sitio de la imagen, los MP restantes descendieron lentamente a la superficie inferior del tubo por gravedad, permaneciendo en la cuerda (consulte el video complementario S5: MP3). .
El ángulo de la cuerda MP cambia a medida que el imán se mueve hacia la derecha por encima del capilar.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 y (d) MP6.El cuadro rojo indica la ampliación que mejora el contraste.Tenga en cuenta que los vídeos adicionales tienen fines informativos, ya que revelan una importante estructura de partículas e información dinámica que no se puede visualizar en estas imágenes estáticas.
Nuestras pruebas han demostrado que mover el imán lentamente hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la tráquea facilita la visualización del MF en el contexto de un movimiento complejo in vivo.No se realizaron pruebas in vivo porque las perlas de poliestireno (MP1 y MP2) no eran visibles en el capilar.Cada uno de los cuatro MF restantes se probó in vivo con el eje largo del imán colocado sobre la tráquea en un ángulo de aproximadamente 30° con la vertical (ver Figuras 2b y 3a), ya que esto dio como resultado cadenas de MF más largas y fue más eficaz. que un imán..configuración finalizada.No se han encontrado MP3, MP4 y MP6 en la tráquea de ningún animal vivo.Al visualizar el tracto respiratorio de las ratas después de matarlas humanamente, las partículas permanecieron invisibles incluso cuando se añadió volumen adicional usando una bomba de jeringa.MP5 tenía el mayor contenido de óxido de hierro y era la única partícula visible, por lo que se utilizó para evaluar y caracterizar el comportamiento de MP in vivo.
La colocación del imán sobre la tráquea durante la inserción de MF dio como resultado que muchas, pero no todas, las MF se concentraran en el campo de visión.La entrada traqueal de partículas se observa mejor en animales sacrificados humanamente.Figura 7 y video complementario S6: MP5 muestra la captura magnética rápida y la alineación de partículas en la superficie de la tráquea ventral, lo que indica que los MP pueden dirigirse a las áreas deseadas de la tráquea.Al buscar más distalmente a lo largo de la tráquea después de la administración de MF, se encontraron algunas MF más cerca de la carina, lo que indica una intensidad de campo magnético insuficiente para recolectar y retener todas las MF, ya que fueron administradas a través de la región de máxima intensidad del campo magnético durante la administración de fluidos.proceso.Sin embargo, las concentraciones posnatales de MP fueron mayores alrededor del área de la imagen, lo que sugiere que muchas MP permanecieron en las regiones de las vías respiratorias donde la intensidad del campo magnético aplicado era mayor.
Imágenes de (a) antes y (b) después de la administración de MP5 en la tráquea de una rata recientemente sacrificada con un imán colocado justo encima del área de imágenes.El área representada se encuentra entre dos anillos cartilaginosos.Hay algo de líquido en las vías respiratorias antes de que se administre el MP.El cuadro rojo indica la ampliación que mejora el contraste.Estas imágenes están tomadas del video presentado en S6: Video complementario MP5.
Mover el imán a lo largo de la tráquea in vivo resultó en un cambio en el ángulo de la cadena MP en la superficie de las vías respiratorias, similar al observado en los capilares (consulte la Figura 8 y el video complementario S7: MP5).Sin embargo, en nuestro estudio, los MP no pudieron ser arrastrados a lo largo de la superficie de los tractos respiratorios vivos, como sí podrían hacerlo los capilares.En algunos casos, la cadena MP se alarga a medida que el imán se mueve hacia la izquierda y hacia la derecha.Curiosamente, también encontramos que la cadena de partículas cambia la profundidad de la capa superficial del fluido cuando el imán se mueve longitudinalmente a lo largo de la tráquea, y se expande cuando el imán se mueve directamente sobre su cabeza y la cadena de partículas se gira a una posición vertical (ver Vídeo complementario S7).: MP5 a las 0:09, abajo a la derecha).El patrón de movimiento característico cambió cuando el imán se movió lateralmente a lo largo de la parte superior de la tráquea (es decir, hacia la izquierda o la derecha del animal, en lugar de a lo largo de la tráquea).Las partículas todavía eran claramente visibles durante su movimiento, pero cuando se retiró el imán de la tráquea, las puntas de las cadenas de partículas se hicieron visibles (consulte el video complementario S8: MP5, a partir del minuto 0:08).Esto concuerda con el comportamiento observado del campo magnético bajo la acción de un campo magnético aplicado en un capilar de vidrio.
Imágenes de muestra que muestran MP5 en la tráquea de una rata viva anestesiada.(a) El imán se utiliza para adquirir imágenes arriba y a la izquierda de la tráquea, luego (b) después de mover el imán hacia la derecha.El cuadro rojo indica la ampliación que mejora el contraste.Estas imágenes pertenecen al vídeo que aparece en el vídeo complementario del S7: MP5.
Cuando los dos polos se sintonizaron en una orientación norte-sur por encima y por debajo de la tráquea (es decir, atrayendo; Fig. 3b), las cuerdas MP parecían más largas y estaban ubicadas en la pared lateral de la tráquea en lugar de en la superficie dorsal de la tráquea. tráquea (ver Apéndice).Vídeo S9:MP5).Sin embargo, no se detectaron altas concentraciones de partículas en un sitio (es decir, la superficie dorsal de la tráquea) después de la administración de líquido usando un dispositivo de doble imán, lo que generalmente ocurre con un dispositivo de un solo imán.Luego, cuando se configuró un imán para repeler polos opuestos (Figura 3c), la cantidad de partículas visibles en el campo de visión no aumentó después de la entrega.Configurar ambas configuraciones de imanes es un desafío debido a la alta intensidad del campo magnético que atrae o empuja los imanes respectivamente.Luego se cambió la configuración a un solo imán paralelo a las vías respiratorias pero que pasaba a través de las vías respiratorias en un ángulo de 90 grados para que las líneas de fuerza cruzaran la pared traqueal ortogonalmente (Figura 3d), una orientación destinada a determinar la posibilidad de agregación de partículas en la pared lateral.ser observado.Sin embargo, en esta configuración, no hubo movimiento de acumulación de MF ni movimiento magnético identificable.Con base en todos estos resultados, se eligió una configuración con un solo imán y una orientación de 30 grados para estudios in vivo de portadores de genes (Fig. 3a).
Cuando se tomaron imágenes del animal varias veces inmediatamente después de ser sacrificado humanamente, la ausencia de interferencia en el movimiento del tejido significó que se podían discernir líneas de partículas más finas y más cortas en el claro campo intercartilaginoso, "balanceándose" de acuerdo con el movimiento de traslación del imán.Ver claramente la presencia y el movimiento de partículas MP6.
El título de LV-LacZ fue de 1,8 x 108 UI/ml, y después de mezclar 1:1 con CombiMag MP (MP6), a los animales se les inyectaron 50 µl de una dosis traqueal de 9 x 107 UI/ml de vehículo LV (es decir, 4,5 x 106 UT/rata).).).En estos estudios, en lugar de mover el imán durante el trabajo de parto, fijamos el imán en una posición para determinar si la transducción del VI podría (a) mejorarse en comparación con la administración vectorial en ausencia de un campo magnético, y (b) si las vías respiratorias podrían estar concentrado.Las células se transducen en las áreas objetivo magnéticas del tracto respiratorio superior.
La presencia de imanes y el uso de CombiMag en combinación con vectores VI no parecieron afectar negativamente la salud animal, al igual que nuestro protocolo estándar de administración de vectores VI.Las imágenes frontales de la región traqueal sometida a perturbación mecánica (Figura 1 complementaria) mostraron que el grupo tratado con LV-MP tenía niveles de transducción significativamente más altos en presencia de un imán (Figura 9a).Solo estuvo presente una pequeña cantidad de tinción azul LacZ en el grupo de control (Figura 9b).La cuantificación de las regiones normalizadas teñidas con X-Gal mostró que la administración de LV-MP en presencia de un campo magnético resultó en una mejora de aproximadamente 6 veces (Fig. 9c).
Ejemplo de imágenes compuestas que muestran transducción traqueal con LV-MP (a) en presencia de un campo magnético y (b) en ausencia de un imán.(c) Mejora estadísticamente significativa en el área normalizada de transducción LacZ en la tráquea con el uso de un imán (*p = 0,029, prueba t, n = 3 por grupo, media ± error estándar de la media).
Las secciones teñidas de rojo neutro rápido (ejemplo que se muestra en la figura complementaria 2) indicaron que las células teñidas con LacZ estaban presentes en la misma muestra y en la misma ubicación que se informó anteriormente.
El desafío clave en la terapia génica de las vías respiratorias sigue siendo la localización precisa de las partículas portadoras en áreas de interés y el logro de un alto nivel de eficiencia de transducción en el pulmón móvil en presencia de flujo de aire y eliminación activa de moco.Para los portadores de VI destinados al tratamiento de enfermedades respiratorias en la fibrosis quística, aumentar el tiempo de residencia de las partículas del portador en las vías respiratorias conductoras era hasta ahora un objetivo inalcanzable.Como señalaron Castellani et al., el uso de campos magnéticos para mejorar la transducción tiene ventajas sobre otros métodos de administración de genes, como la electroporación, porque puede combinar simplicidad, economía, administración localizada, mayor eficiencia y un tiempo de incubación más corto.y posiblemente una dosis más baja de vehículo10.Sin embargo, nunca se ha descrito la deposición in vivo y el comportamiento de partículas magnéticas en las vías respiratorias bajo la influencia de fuerzas magnéticas externas y, de hecho, no se ha demostrado in vivo la capacidad de este método para aumentar los niveles de expresión génica en vías respiratorias vivas intactas.
Nuestros experimentos in vitro en el sincrotrón PCXI mostraron que todas las partículas que probamos, con la excepción del poliestireno MP, eran visibles en la configuración de imágenes que utilizamos.En presencia de un campo magnético, los campos magnéticos forman cuerdas, cuya longitud está relacionada con el tipo de partículas y la fuerza del campo magnético (es decir, la proximidad y el movimiento del imán).Como se muestra en la Figura 10, las cuerdas que observamos se forman a medida que cada partícula individual se magnetiza e induce su propio campo magnético local.Estos campos separados hacen que otras partículas similares se acumulen y se conecten con movimientos de cuerdas grupales debido a las fuerzas locales de atracción y repulsión de otras partículas.
Diagrama que muestra (a, b) cadenas de partículas que se forman dentro de capilares llenos de líquido y (c, d) una tráquea llena de aire.Tenga en cuenta que los capilares y la tráquea no están dibujados a escala.El panel (a) también contiene una descripción de los MF que contienen partículas de Fe3O4 dispuestas en cadenas.
Cuando el imán se movió sobre el capilar, el ángulo de la cadena de partículas alcanzó el umbral crítico para MP3-5 que contiene Fe3O4, después del cual la cadena de partículas ya no permaneció en su posición original, sino que se movió a lo largo de la superficie hasta una nueva posición.imán.Es probable que este efecto se produzca porque la superficie del capilar de vidrio es lo suficientemente lisa como para permitir que se produzca este movimiento.Curiosamente, MP6 (CombiMag) no se comportó de esta manera, tal vez porque las partículas eran más pequeñas, tenían un recubrimiento o carga superficial diferente, o el fluido portador patentado afectó su capacidad de moverse.El contraste en la imagen de partículas del CombiMag también es más débil, lo que sugiere que el líquido y las partículas pueden tener la misma densidad y, por lo tanto, no pueden moverse fácilmente entre sí.Las partículas también pueden atascarse si el imán se mueve demasiado rápido, lo que indica que la intensidad del campo magnético no siempre puede superar la fricción entre las partículas en el fluido, lo que sugiere que la intensidad del campo magnético y la distancia entre el imán y el área objetivo no deberían ser un factor determinante. sorpresa.importante.Estos resultados también indican que, aunque los imanes pueden capturar muchas micropartículas que fluyen a través del área objetivo, es poco probable que se pueda confiar en que los imanes muevan las partículas de CombiMag a lo largo de la superficie de la tráquea.Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que los estudios de MF del VI in vivo deberían utilizar campos magnéticos estáticos para apuntar físicamente a áreas específicas del árbol de las vías respiratorias.
Una vez que las partículas ingresan al cuerpo, son difíciles de identificar en el contexto del complejo tejido en movimiento del cuerpo, pero su capacidad de detección se ha mejorado moviendo el imán horizontalmente sobre la tráquea para "mover" las cuerdas MP.Si bien es posible obtener imágenes en tiempo real, es más fácil discernir el movimiento de las partículas después de que el animal ha sido sacrificado humanamente.Las concentraciones de MP generalmente eran más altas en este lugar cuando el imán se colocaba sobre el área de la imagen, aunque algunas partículas generalmente se encontraban más abajo en la tráquea.A diferencia de los estudios in vitro, las partículas no pueden ser arrastradas por la tráquea mediante el movimiento de un imán.Este hallazgo es consistente con cómo el moco que cubre la superficie de la tráquea típicamente procesa las partículas inhaladas, atrapándolas en el moco y posteriormente eliminándolas a través del mecanismo de eliminación mucociliar.
Planteamos la hipótesis de que el uso de imanes encima y debajo de la tráquea para atraer (Fig. 3b) podría dar como resultado un campo magnético más uniforme, en lugar de un campo magnético altamente concentrado en un punto, lo que podría dar como resultado una distribución más uniforme de partículas..Sin embargo, nuestro estudio preliminar no encontró evidencia clara que respalde esta hipótesis.De manera similar, configurar un par de imanes para que se rechacen (Fig. 3c) no provocó que más partículas se depositaran en el área de la imagen.Estos dos hallazgos demuestran que la configuración de doble imán no mejora significativamente el control local del apuntamiento MP y que las fuertes fuerzas magnéticas resultantes son difíciles de sintonizar, lo que hace que este enfoque sea menos práctico.De manera similar, orientar el imán por encima y a través de la tráquea (Figura 3d) tampoco aumentó la cantidad de partículas que permanecían en el área de la imagen.Es posible que algunas de estas configuraciones alternativas no tengan éxito ya que dan como resultado una reducción de la intensidad del campo magnético en la zona de deposición.Por lo tanto, la configuración de un solo imán a 30 grados (Fig. 3a) se considera el método de prueba in vivo más simple y eficiente.
El estudio LV-MP demostró que cuando los vectores LV se combinaron con CombiMag y se administraron después de haber sido perturbados físicamente en presencia de un campo magnético, los niveles de transducción aumentaron significativamente en la tráquea en comparación con los controles.Según los estudios de imágenes de sincrotrón y los resultados de LacZ, el campo magnético parecía ser capaz de mantener el VI en la tráquea y reducir la cantidad de partículas vectoriales que penetraban inmediatamente en lo profundo del pulmón.Estas mejoras en la focalización pueden conducir a una mayor eficiencia y al mismo tiempo reducir los títulos administrados, la transducción no dirigida, los efectos secundarios inflamatorios e inmunológicos y los costos de transferencia de genes.Es importante destacar que, según el fabricante, CombiMag se puede utilizar en combinación con otros métodos de transferencia de genes, incluidos otros vectores virales (como el AAV) y ácidos nucleicos.