Giardia duodenum es un organismo parásito que causa la giardiasis, una infección intestinal especialmente común en niños pequeños con signos clínicos de diarrea.Anteriormente hemos informado que G. duodenalis extracelular desencadena la activación de los nucleótidos de unión del receptor intracelular similar a la oligomerización 3 (NLRP3) y regula las respuestas inflamatorias del huésped a través de la secreción de vesículas extracelulares (EV).Sin embargo, aún no se han dilucidado los patrones moleculares exactos del EV duodenocócico (GEV) asociado al patógeno implicado en este proceso y el papel del inflamasoma NLRP3 en la giardiasis.
Se construyeron plásmidos de expresión eucariótica recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 y alfa-7.3 giardinas en GEV, se transfectaron en macrófagos peritoneales primarios de ratón y se detectaron midiendo la molécula objetivo de la inflamación caspasa-1.Se analizó el nivel de expresión de p20..Las giardinas alfa-2 y alfa-7.3 de G. duodenalis se identificaron originalmente midiendo el inflamasoma NLRP3 (NLRP3, pro-interleucina-1 beta [IL-1β], pro-caspasa-1 y caspasa-1 p20), secreción de IL.Niveles de 1β, niveles de oligomerización de proteína manchada apoptótica (ASC) y localización inmunofluorescente de NLRP3 y ASC.Luego se evaluó el papel del inflamasoma NLRP3 en la patogenicidad de G. duodenalis utilizando ratones en los que se bloqueó la activación de NLRP3 (ratones bloqueados con NLRP3) y se controlaron los cambios patológicos en el peso corporal, la carga parasitaria duodenal y el tejido duodenal.Además, investigamos si las hiardinas alfa-2 y alfa-7.3 inducen la secreción de IL-1β in vivo a través del inflamasoma NLRP3 y determinamos el papel de estas moléculas en la patogenicidad de G. duodenalis en ratones.
Las giardinas alfa-2 y alfa-7.3 inducen la activación del inflamasoma NLRP3 in vitro.Esto condujo a la activación de p20 caspasa-1, un aumento en los niveles de expresión de las proteínas NLRP3, pro-IL-1β y pro-caspasa-1, un aumento significativo en la secreción de IL-1β, la formación de manchas de ASA en el citoplasma y la inducción de la oligomerización de ASA.Inflamación por NLRP3 La pérdida del pene exacerba la patogenicidad de G. duodenalis en ratones.Los ratones tratados con quistes mediante alimentación forzada procedentes de ratones bloqueados con NLRP3 mostraron un mayor número de trofozoítos y daños graves en las vellosidades duodenales, caracterizados por criptas necróticas encogidas y ramificadas.Experimentos in vivo han demostrado que las giardinas alfa-2 y alfa-7.3 pueden inducir la secreción de IL-1β a través del inflamasoma NLRP3, y la inmunización con giardinas alfa-2 y alfa-7.3 redujo la patogenicidad de G. duodenalis en ratones.
En conjunto, los resultados de este estudio sugieren que giardia alfa-2 y alfa-7.3 provocan una regulación positiva de la inflamación NLRP3 del huésped y reducen la infectividad de G. duodenalis en ratones, que son objetivos prometedores para prevenir la giardiasis.
Giardia duodenum es un parásito protozoario extracelular que vive en el intestino delgado y causa 280 millones de casos de giardiasis con diarrea anualmente, especialmente entre niños pequeños en países en desarrollo [1].Las personas se infectan al beber agua o alimentos contaminados con quistes de M. duodeno, que luego ingresan al estómago y se excretan en los jugos gástricos.Los trofozoitos de Giardia duodeno se adhieren al epitelio duodenal y provocan náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal y pérdida de peso.Las personas con inmunodeficiencia y fibrosis quística son susceptibles a la infección.La infección también puede ocurrir a través del sexo oral y anal [2].Fármacos como metronidazol, tinidazol y nitazoxanida son las opciones de tratamiento preferidas para las infecciones duodenales [3].Sin embargo, estos fármacos de quimioterapia provocan efectos secundarios adversos como náuseas, carcinogénesis y genotoxicidad [4].Por tanto, es necesario desarrollar estrategias más eficaces para prevenir la infección por G. duodenalis.
Los inflamasomas son una clase de complejos de proteínas citosólicas que forman parte de la respuesta inmune innata, ayudando a defenderse contra la invasión de patógenos y mediando las respuestas inflamatorias [5].Entre estos inflamasomas, el inflamasoma similar a la unión de nucleótidos (NLRP3) del oligomerización de unión a nucleótidos (NOD) se ha estudiado ampliamente porque puede detectarse mediante varios patrones moleculares asociados a patógenos/daños (PAMP/ DAMP), reconoce, activa el sistema inmunológico innato.y regula la homeostasis intestinal en muchas enfermedades inflamatorias [6,7,8].Consiste en el receptor de reconocimiento de patrones (PRR) NLRP3, una proteína manchada apoptótica adaptadora (ASC) y una procaspasa-1 efectora o procaspasa-11.El inflamasoma NLRP3 actúa como huésped contra la invasión de patógenos, como se observa en estudios de Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] y Leishmania.[11], pero también se ha informado que la activación del inflamasoma NLRP3 limita las respuestas inmunitarias protectoras y exacerba la progresión de la enfermedad, por ejemplo, en los gusanos [12].Con base en nuestros hallazgos anteriores, informamos que G. duodenalis extracelular desencadena la activación intracelular de la inflamación NLRP3 y modula las respuestas inflamatorias del huésped mediante la secreción de vesículas extracelulares (EV) [13].Sin embargo, aún no se ha determinado el papel del inflamasoma NLRP3 en la infección por G. duodenalis in vivo.
Las giardinas se describieron originalmente como componentes estructurales del citoesqueleto de G. duodenalis y desempeñan un papel importante en la motilidad de los trofozoítos y la unión de las células epiteliales en el intestino delgado.Para adaptarse mejor al medio ambiente y aumentar su patogenicidad, los trofozoítos de G. duodenalis desarrollaron una estructura citoesquelética única que consta de 8 flagelos, 1 cuerpo medio y 1 disco ventral [14].Los trofozoítos de Giardia duodeno utilizan su citoesqueleto para penetrar la parte superior del intestino delgado, especialmente el duodeno, y unirse a los enterocitos.Migran constantemente y se adhieren a las células epiteliales mediante el metabolismo celular.Por tanto, existe una estrecha relación entre su citoesqueleto y su virulencia.Las giardinas específicas de Giardia duodenum son componentes de la estructura del citoesqueleto [15] y se dividen en cuatro clases: α-, β-, γ- y δ-giardinas.Hay 21 miembros de la familia de las α-giaardinas, todos los cuales tienen una capacidad dependiente del calcio para unirse a los fosfolípidos [16].También conectan el citoesqueleto con la membrana celular.En personas con diarrea causada por G. duodenalis, las α-giardinas se expresan altamente y son inmunorreactivas durante la infección [17].Las vacunas heterólogas basadas en Giardia alfa-1 protegieron contra la giardiasis en ratones y son antígenos candidatos potenciales para el desarrollo de vacunas [18].La alfa-8 giardina, localizada en la membrana plasmática y los flagelos, pero no en el disco ventral, mejora la motilidad y la tasa de crecimiento de los trofozoítos en G. duodenalis [19].La alfa-14 giardina se adhiere a las estructuras de microtúbulos de los flagelos y afecta la viabilidad de G. duodenalis [20].La alfa-11 giardina está presente en abundancia durante todo el ciclo de vida y la sobreexpresión de alfa-11 giardina daña a la propia G. duodenalis [21].Sin embargo, no está claro si la alfa-2 giardina y la alfa-7.3 giardina protegen contra la infección por G. duodenalis y sus mecanismos subyacentes.
En este estudio, los plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina y pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina se transfectaron en macrófagos peritoneales primarios de ratón para activar el huésped NLRP3.Luego se examinaron los objetivos inflamasómicos.También evaluamos el papel del inflamasoma NLRP3 en la patogenicidad de G. duodenalis, investigamos si las giardinas alfa-2 y alfa-7,3 inducen la activación del inflamasoma NLRP3 in vivo y determinamos que estas dos funciones de las giardinas en la patogenicidad de G. duodenalis.Nuestro objetivo común era desarrollar objetivos prometedores para la prevención de la infección por G. duodenalis.
Se compraron ratones hembra C57BL / 6 de tipo salvaje (WT) de 5 a 8 semanas de edad en el Centro Experimental de Animales Liaoning Changsheng (Liaoning, China).Los ratones tuvieron libre acceso al agua, recibieron alimentos esterilizados y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas.Antes de la infección, los ratones recibieron antibióticos ad libitum en agua potable suplementada con ampicilina (1 mg/ml), vancomicina (1 mg/ml) y neomicina (1,4 mg/ml) (todos adquiridos en Shanghai, China, organismos artificiales) [22 ].].Los ratones que perdieron la capacidad de comer y beber durante > 24 horas y perdieron ≥ 20% de peso corporal fueron sacrificados humanamente mediante dislocación cervical.
Los trofozoítos de WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, EE. UU.) se complementaron con un 12,5 % de suero bovino fetal (FBS; Every Green, Zhejiang, China) y un 0,1 % de bilis bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, EE. UU.) ).EE.UU.) en condiciones microaeróbicas.Los trofozoitos confluentes se recogieron en hielo y se pasaron en una proporción de 1:4 para su posterior reproducción.
Los quistes de Giardia duodeno se indujeron como se describió anteriormente [23], los trofozoítos se recolectaron en fase logarítmica y luego se diluyeron con medio inductor de encapsulación, pH 7,1 (TYI-S-33 modificado) hasta una concentración final de 1 × 106 trofozoítos/ml.concentración de bilis 0,05% medio).Los trofozoítos se cultivaron en condiciones anaeróbicas a 37°C hasta la fase de crecimiento logarítmico.Cambie el medio a medio inductor de quistes (pH 7,8; ​​medio TYI-S-33 modificado con una concentración de bilis del 1%) y cultive G. duodenalis a 37 ° C durante 48 a 96 horas, durante las cuales se observaron los quistes de formación bajo un microscopio.Después de que se indujo a la mayoría de los trofozoítos a formar quistes, se recogió la mezcla de cultivo y se resuspendió en agua desionizada estéril para lisar los trofozoítos restantes.Los quistes se contaron y almacenaron a 4°C para análisis posteriores a través de una sonda gástrica en ratones.
Las vesículas extracelulares de Giardia (GEV) se enriquecieron como se describió anteriormente [13].Los trofozoítos en fase de crecimiento logarítmico se resuspendieron en medio TYI-S-33 modificado preparado con FBS empobrecido en exosomas (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) hasta una concentración final de 1 × 106 parásitos/ml y se incubaron durante 12 horas.Se aislaron del sobrenadante del cultivo mediante centrifugación a 2000 g durante 10 min, 10000 g durante 45 min y 100000 g durante 60 min.Los precipitados se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se almacenaron a -80 °C o se usaron directamente para análisis adicionales.
Los macrófagos peritoneales primarios de ratón se prepararon como se describió anteriormente [24].Brevemente, a ratones (de 6 a 8 semanas de edad) se les inyectó (por vía intraperitoneal [ip]) 2,5 ml de medio de tioglicol líquido Difco al 2,98 % (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) y se les alimentó con 3-4 paladares.Se recogió una suspensión de macrófagos de la cavidad abdominal de ratones después de la eutanasia y se centrifugó 3 veces a 1000 g durante 10 minutos.Las células recolectadas se detectaron mediante citometría de flujo usando el marcador CD11b hasta que la pureza celular fue >98 %, luego se agregaron a placas de cultivo celular de 6 pocillos (4,5 x 106 células/pocillo) y se incubaron con FBS al 10 % (Bioindustry) a 37 °C.y 5% CO2.
Se extrajo ARN de 1 × 107 trofozoitos en 1 ml de reactivo TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), se extrajo ADN genómico del ARN total de G. duodenalis utilizando MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) y se sintetizó ADN complementario (ADNc). utilizando MonScript RTIIII Super Mix (Monad) según las instrucciones del fabricante.
La información de la secuencia CDS para el gen objetivo de G. duodenalis se obtuvo del NCBI GenBank.Utilice Primer 5.0 para diseñar cebadores de clonación continuos específicos para cada gen objetivo.El cebador directo (5′-3′) consta de tres partes: una secuencia superpuesta con un vector linealizado pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) y codones de inicio ATG y GNN (si la primera base no es G).Esto se hace para mejorar la eficiencia de la expresión.Además, al menos 16 pb de bases combinadas (contenido de GC 40–60 %/Tm aproximadamente 55 °C).El cebador inverso (5′-3′) consta de dos partes, una secuencia superpuesta con un vector pcDNA3.1(+) linealizado con EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) y una base combinada de al menos 16 pb.(excluyendo las dos últimas paradas).bases) un codón como AA o GA para permitir que los plásmidos recombinantes expresen sus proteínas marcadas).Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1 y fueron sintetizadas por Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Los objetivos se amplificaron utilizando ADN polimerasa Pfu (Tiangen, Beijing, China) o Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) utilizando ADNc de G. duodenalis preparado como plantilla.El plásmido pcDNA3.1(+) del vector de expresión eucariótico se linealizó con la enzima de restricción EcoRV y se desfosforiló utilizando Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Los fragmentos linealizados de pcDNA3.1(+) y los fragmentos del gen diana amplificados se purificaron utilizando un kit de purificación de gel de ADN (Tiangen) y se cuantificaron utilizando un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).El fragmento pcDNA3.1(+) y cada fragmento del gen diana se recombinaron utilizando la mezcla de clonación de ensamblaje único MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN utilizando Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Los plásmidos libres de endotoxinas pcDNA3.1 (+) -alfa-2 y pcDNA3.1 (+) -alfa-7.3 se generaron utilizando el mini kit de plásmidos sin endotoxinas SanPrep (Sangon Biotech).La concentración se mantuvo por encima de 500 ng/μl para garantizar que el EDTA en el tampón de elución no interfiriera con el ensayo de transfección.Se cultivaron macrófagos peritoneales primarios de ratón en placas de 6 pocillos con medio RPMI 1640 completo (Biological Industries) durante 12 horas, luego las células se lavaron 3 veces en PBS tibio para eliminar la penicilina y la estreptomicina, y luego en medio suplementado con medio completo.Los plásmidos libres de endotoxinas pcDNA3.1(+)-alfa-2 y pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 µg) se diluyeron en 125 µl de medio de suero reducido Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Luego se diluyeron 5 µl de reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) en 125 µl de medio Opti-MEM con bajo contenido de suero.Prepare complejos liposoma-ADN mezclando el plásmido libre de endotoxinas diluido con Lipofectamine 2000 y dejando reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos.Transfiera los complejos por separado a las células de cada pocillo y mezcle lentamente.Después de 4 horas, el medio de cultivo celular se reemplazó con 2 ml de medio RPMI 1640 completo y el cultivo continuó durante 24 horas.Se añadió medio de cultivo celular fresco a las células y se incubaron durante varios momentos según el diseño del ensayo.
Se prepararon muestras de proteínas de sobrenadantes y lisados ​​​​celulares como se describió anteriormente [25].Los parámetros de transferencia de membrana para pro-IL-1β, pro-caspasa-1, caspasa-1 p20, NLRP3, β-actina y etiqueta His fueron 200 mA/90 min.Para interleucina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EE. UU.), caspasa-1 (p20) (Adipogen, Suiza) y NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Suiza) y 1:5000 dirigido a la etiqueta His (Amylet Scientific, Wuhan, China) y β-actina (Proteintech, Wuhan, China).
La reticulación con suberato de disuccinimida (DSS) se realizó como se describió anteriormente [26].Las células se lavaron 3 veces con PBS frío y se lisaron completamente con una aguja de calibre 27 en 50 µl de tampón de reacción ASC (pH 8,0) que contenía Na2PO4 25 mM, NaCl 187,5 mM, HEPES 25 mM y NaHCO3 125 mM.La mezcla se centrifugó a 5000 g durante 3 minutos y el sedimento se suturó con 10 µl de DSS (25 mM en DMSO) y 40 µl de tampón de reacción ASC durante 30 minutos a 37°C.Después de la centrifugación a 5000 g durante 10 minutos, el sedimento se disolvió en una solución de 40 µl de tampón de reacción ASC y 10 µl de tampón de carga de proteínas 6x (TransGen, Beijing, China), y luego la solución se inactivó a temperatura ambiente durante 15 minutos. mín.Luego hervir durante 10 minutos.Luego, las muestras de proteínas se sometieron a transferencia Western utilizando anticuerpos anti-ASC primarios (Wanleibio, Shenyang, China) en una proporción de dilución de 1:500.
Siguiendo un procedimiento descrito previamente [13], se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se determinó la secreción de la citocina proinflamatoria IL-1β utilizando el kit ELISA IL-1 Beta de ratón (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Convierta los valores de OD450nm en concentraciones de proteínas utilizando la curva estándar de IL-1β.
Las células recubiertas sobre cubreobjetos se lavaron suavemente 3 veces en PBS tibio, se fijaron en fijador de células tisulares (Biosharp, Beijing, China) durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT), en Triton X-Permeabilize al 0,1% a 100 (diluido en PBS; Biosharp ) durante 20 minutos a temperatura ambiente y bloquear en albúmina sérica bovina al 5% (en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente.Luego, las células se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra ASC (dilución 1:100) o NLRP3 (dilución 1:100), respectivamente, e IgG anti-conejo de cabra marcada con Cy3 (H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, EE. UU.) o IgG anti-ratón de cabra conjugada con FITC (1:400; Earthox) durante la noche a 37 °C en la oscuridad durante 1 hora.Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) durante 5 minutos y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus Corporation, Tokio, Japón).
Los ratones se dividieron en cuatro grupos (n = 7 en cada grupo): (i) grupo de control negativo tratado con PBS (solo PBS; alimentación forzada con 100 µl/ratón de PBS seguido de una inyección intraperitoneal diaria de 100 µl/ratón PBS 3 horas después)., de forma continua durante 7 días);(ii) grupo de control negativo tratado con inhibidor de MCC950 [27] (100 µl/ratón mediante sonda nasogástrica con PBS, 3 horas más tarde, se administraron 10 mg/kg de peso corporal [PC] de MCC950 [en PBS] por vía intraperitoneal diariamente, duración de 7 días);(iii) grupo de infección por quistes de G. duodenalis (1,5 x 106 quistes/ratón mediante alimentación forzada, 3 horas después, 100 µl/ratón de PBS administrado por vía intraperitoneal diariamente durante 7 días);(iv) Grupo de tratamiento con inhibidor de MCC950 del grupo de infección combinada del quiste de G. duodenalis (1,5 × 106 quistes/ratón mediante sonda forzada, 10 mg/kg de peso corporal de MCC950 por vía intraperitoneal al día durante 7 días a las 3 h).El peso corporal de cada ratón se controló diariamente y todos los ratones fueron sacrificados el séptimo día.El duodeno recolectado (3 cm de largo) se cortó en trozos pequeños en 1 ml de PBS, los quistes se destruyeron durante la noche en PBS a 4°C y los trofozoítos de G. duodenalis.Se aisló duodeno fresco (1 cm de largo) para tinción con hematoxilina y eosina (H&E).
Los ratones se dividieron en dos grupos: (i) grupo de control MOCK y (ii) grupo inhibidor de MCC950.Hubo cinco tratamientos en cada grupo (n = 7/grupo de tratamiento): (i) grupo de control negativo con tratamiento con PBS (solo PBS; 100 µl/ratón de PBS, inyección intramuscular (IM) (tibial anterior) [28, 29];( ii) grupo de control negativo del plásmido pcDNA3.1(+) (100 µg/ADN de ratón, mediante inyección intramuscular) (iii) grupo de control positivo de infección por quistes de G. duodenalis (1,5 x 106 quistes/ratón, mediante alimentación forzada) (iv) a grupo tratado con plásmido pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 µg/ADN de ratón, mediante inyección intramuscular), y (v) un grupo tratado con plásmido pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/ratón ADN, después de 12 horas de pase, los ratones del grupo inhibidor de MCC950 recibieron una inyección intraperitoneal diaria de MCC950 (10 mg/kg de peso corporal) durante 7 días, mientras que los ratones del grupo MOCK recibieron un volumen igual de tratamiento con PBS. Se recogieron de los globos oculares de los ratones y se dejaron durante la noche a 4 ° C. Se aislaron muestras de suero mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y se midieron los niveles de IL-1β.
Se dividieron treinta y cinco ratones en cinco grupos (n=7/grupo).El grupo 1 fue un grupo de control negativo tratado con PBS: los ratones recibieron 100 µl de PBS por vía intramuscular y 3 días después mediante alimentación forzada.El grupo 2 es un grupo de control positivo infectado con quistes de G. duodenalis: a los ratones se les inyectaron 100 µl de PBS y 3 días después se les inyectaron por vía intragástrica 1,5 x 106 quistes/ratón.Tercer grupo: inmunización con plásmido con pcDNA3.1(+) en combinación con un grupo de control para la infección por quistes duodenales: los ratones recibieron 100 μg de ADN plasmídico pcDNA3.1(+)(im) por vía oral, 1,5×106 quistes/ratón 3 durante varios días.Los grupos 4 y 5 eran plásmido de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 recombinante o plásmido de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 en combinación con infección por quiste de G. duodenalis.Grupo experimental: los ratones recibieron 100 µg de pcDNA3.ADN del plásmido 1 (+) -giardina (im), luego, 3 días después, se inyectaron 1, 5 × 106 quistes / ratón mediante sonda nasogástrica.El peso corporal de cada ratón se controló después de la introducción del quiste de G. duodenalis a través del tubo.Se recogió duodeno fresco para medir la carga parasitaria y analizar la tinción HE.
Los cambios histopatológicos se analizaron según un procedimiento publicado previamente [30].El duodeno fresco se fijó con fijador de células tisulares, se embebió en parafina, se cortó en secciones de 4 μm, se tiñó con H&E y se analizó con un microscopio óptico.Un patólogo que desconocía el tratamiento evaluó cambios patológicos representativos en siete secciones de tejido de siete ratones independientes y se capturaron con un aumento de 200x.La longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas se midieron de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
Los resultados in vitro e in vivo se obtuvieron por triplicado.Los gráficos se generaron utilizando GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).Las diferencias entre dos grupos se analizaron mediante la prueba t, mientras que las diferencias entre ≥3 grupos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el software SPSS (versión 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.).Los datos se analizaron para determinar la homogeneidad de la varianza utilizando la prueba de Levene seguida de la prueba post hoc de Bonferroni (B).La significancia se expresa como P<0,05, P<0,01 y P<0,001 (no significativo [ns]) (P>0,05).
Nuestro análisis previo de la proteómica del GEV en la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) mostró que muchos objetivos pueden estar involucrados en la activación de las vías de señalización inflamatorias [13].Seleccionamos dos objetivos prometedores, giardinas alfa-2 y alfa-7.3, amplificamos estas moléculas y las usamos para construir el vector de expresión eucariota pcDNA3.1(+).Después de la secuenciación, se transfectaron plásmidos de expresión de giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 y alfa-7.3 recombinantes en macrófagos peritoneales primarios de ratón, y se identificó la proteína de inflamación distintiva caspasa-1 p20 (un fragmento de caspasa-1 activada). como dilucidar moléculas clave que pueden desencadenar la inflamación.Los resultados mostraron que las giardinas alfa-2 y alfa-7.3 pueden inducir la expresión de p20 caspasa-1 similar a GEV.No se encontró ningún efecto sobre la activación de caspasa-1 en el control negativo no tratado (solo PBS) y en el control de plásmido pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Medición de la activación de p20 caspasa-1 por pcDNA3.1(+)-alfa-2 y alfa-7.3 giardinas.Los plásmidos de expresión eucariótica recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 y alfa-7.3 giardinas (sobre cada carril) se transfectaron en macrófagos peritoneales primarios de ratón y los sobrenadantes del cultivo se recogieron 24 horas después.Se utilizó transferencia Western para medir los niveles de expresión de la proteína inflamasoma p20 caspasa-1 distintiva.El grupo de tratamiento solo con PBS (carril C) y el grupo de monoterapia con pcDNA3.1(+) (carril pcDNA3.1) se utilizaron como control negativo, y el grupo de tratamiento con GEV se utilizó como control positivo.La expresión de la proteína recombinante se confirmó detectando una etiqueta de histidina en cada proteína, y las bandas de proteína esperadas eran alfa-2 giardina (38,2 kDa) y alfa-7,3 giardina (37,2 kDa).GEV, vesículas extracelulares de Giardia duodeno, pcDNA3.1(+), vector linealizado con EcoRV, SUP, sobrenadante
Para determinar si la alfa-2 giardina y la alfa-7.3 giardina inducen la expresión de p20 caspasa-1 y desempeñan un papel en la activación de la respuesta inflamatoria NLRP3 del huésped, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina y pcDNA3.1(+)-alfa Se transfectó -7.3 giardin en macrófagos peritoneales primarios de ratón con ADN plasmídico recombinante y se determinaron los niveles de expresión, localización y oligomerización de las proteínas inflamatorias clave NLRP3.En este experimento, se utilizó GEV como grupo de control positivo, y el grupo sin tratamiento (solo PBS) o el grupo de tratamiento con transfección pcDNA3.1(+) fue el grupo negativo.Los resultados mostraron que, al igual que en el grupo GEV, el ADN plasmídico recombinante de giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 y giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 dio como resultado una regulación positiva de NLRP3, pro-IL-1β y Activación de procaspasa-1 y caspasa-1 (Fig. 2a).Además, ambas giardinas indujeron una secreción significativa de IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figura 2b).La mayoría de las proteínas ASC eran monoméricas en el grupo sin tratamiento o en el grupo de tratamiento transfectado con el plásmido pcDNA3.1(+), en contraste con pcDNA3.1(+)-alfa-2 o pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardinas.La oligomerización de ASC se produjo en el ADN plasmídico recombinante del grupo o grupo de control positivo de GEV, mostrando una forma oligomérica (Figura 2c).Estos datos preliminares sugieren que la alfa-2 giardina y la alfa-7,3 giardina pueden inducir la activación de la inflamación NLRP3.Estudios inmunofluorescentes posteriores de la localización de ASC y NLRP3 mostraron que en el grupo de control negativo, la proteína ASC estaba dispersa por todo el citoplasma y aparecía como una señal puntual tras la estimulación de pcDNA3.1(+)-alfa-2 con giardina o pcDNA3.Grupo 1(+)-alfa-7,3 giardina o grupo de control positivo GEV (Figura 2d).En los grupos de control negativo y pcDNA 3.1 tratado con plásmido, no se detectó la señal de la proteína NLRP3, mientras que un punto de señal fluorescente en respuesta a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 fue detectado..giardina se encuentran en el citoplasma o tras la estimulación del HEV (Fig. 2e).Estos datos demuestran además que G. duodenalis giardin alfa-2 y giardin alfa-7.3 activan el inflamasoma NLRP3 en macrófagos peritoneales primarios de ratón.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin y pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin activan el inflamasoma NLRP3 en macrófagos peritoneales de ratón.Transfecte los plásmidos de expresión eucarióticos recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin y pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin en macrófagos y células peritoneales murinos primarios, o recolecte el sobrenadante dentro de las 24 h para el análisis de expresión y oligomerización. , secreción.y localización de proteínas inflamatorias clave.El grupo de solo PBS (C) y el grupo de tratamiento único pcDNA3.1(+) se utilizaron como control negativo, y el grupo de tratamiento con GEV se utilizó como grupo positivo.a Las proteínas inflamatorias clave NLRP3, incluidas NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspasa-1 y p20 caspasa-1, se detectaron mediante transferencia Western.b Los niveles de secreción de IL-1β en los sobrenadantes se determinaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).Las diferencias entre los grupos control y experimental se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el software SPSS versión 22.0.Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos **P<0,01 y ***P<0,001.c Los niveles de oligomerización de ASC en los sedimentos se determinaron mediante análisis de entrecruzamiento DSS, mientras que los niveles de ASC en lisados ​​celulares se usaron como control de carga.d Visualización de la localización de ISC mediante inmunofluorescencia.e Se utilizó inmunofluorescencia para visualizar la localización de NLRP3.ASC, proteína apoptótica tipo mota;IL, interleucina;NLRP3, receptor 3 similar a la oligomerización de unión a nucleótidos;ns, no significativo (P > 0,05)
Tanto G. duodenalis como los GEV que secreta activan el inflamasoma NLRP3 y regulan las respuestas inflamatorias del huésped in vitro.Por tanto, el papel del inflamasoma NLRP3 en la patogenicidad de G. duodenalis sigue sin estar claro.Para investigar este problema, diseñamos un experimento entre ratones infectados con quiste de G. duodenalis y ratones infectados con quiste de G. duodenalis + tratamiento con inhibidor de MCC950 y comparamos la expresión del inflamasoma NLRP3 cuando se infectan con quiste de G. duodenalis.En la Fig. 3a se muestra un esquema detallado del experimento.Se controlaron los cambios en el peso corporal de los ratones en diferentes grupos de tratamiento durante 7 días después de la infección con quistes, y los resultados se muestran en la Fig. 3b.En comparación con el grupo tratado con PBS puro, los resultados mostraron que (i) el peso corporal de los ratones infectados con quiste de G. duodenalis disminuyó del día 3 al día 7 después de la infección;(ii) el tratamiento con el inhibidor de MCC950 no tuvo ningún efecto significativo sobre el peso corporal de los ratones..En comparación con el grupo de infección única, el peso corporal del grupo de infección duodenal tratado con MCC950 disminuyó en diversos grados (Día 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Día 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001; Día 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Día 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Día 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175; Día 7: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Estos datos demuestran que el inflamasoma NLRP3 protege a los ratones de una pérdida de peso significativa en las primeras etapas (2 a 4 días) de la infección duodenal.Luego intentamos detectar trofozoítos de G. duodenalis en el líquido de lavado duodenal y los resultados se muestran en la Figura 3c.En comparación con el grupo de infección por quistes de G. duodenalis, el número de trofozoítos en el duodeno aumentó significativamente después de bloquear el inflamasoma NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Los tejidos duodenales teñidos con HE mostraron, en comparación con el control negativo tratado con PBS y MCC950 solo: (i) la infección por quiste de G. duodenalis provocó daño a las vellosidades duodenales (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) y atrofia de las criptas (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodeno de ratones infectados con quistes de G. duodenalis y tratados con inhibidores de MCC950.las vellosidades duodenales estaban dañadas y muertas (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) con atrofia y ramificación de las criptas (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f).Estos resultados sugieren que el inflamasoma NLRP3 desempeña un papel en la reducción de la patogenicidad de G. duodenalis.
Papel del inflamasoma NLRP3 en la infección por Giardia duodeno.Los ratones fueron sondados (iv) con quistes duodenocócicos y luego tratados con o sin MCC950 (ip).Se utilizaron como controles grupos de tratamiento único con PBS o MCC950.Grupo experimental y régimen de tratamiento.b El peso corporal de los ratones en cada uno de los diversos grupos de tratamiento se controló durante 7 días.La diferencia entre el grupo de infección por G. duodenalis y el grupo de tratamiento de infección por G. duodenalis + MCC950 se analizó mediante la prueba t utilizando el software SPSS versión 22.0.Los asteriscos indican diferencias significativas en *P<0,05, **P<0,01 o ***P<0,001.c La carga parasitaria se determinó contando el número de trofozoítos en el líquido de lavado duodenal.La diferencia entre el grupo de infección por G. duodenalis y el grupo de tratamiento de infección por G. duodenalis + MCC950 se analizó mediante la prueba t utilizando el software SPSS versión 22.0.Los asteriscos indican diferencias significativas en *P < 0,05.d Resultados de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de la histopatología duodenal.Las flechas rojas indican daño a las vellosidades, las flechas verdes indican daño a las criptas.Barra de escala: 100 µm.e, f Análisis estadístico de la altura de las vellosidades duodenales y la altura de las criptas del ratón.Los asteriscos indican diferencias significativas en *P<0,05 y **P<0,01.Los resultados se toman de 7 experimentos biológicos independientes.PC, peso corporal;ig, vía de parto intragástrica;ip: vía de entrega intraperitoneal;ns, no significativo (P > 0,05);PBS, solución salina tamponada con fosfato;Peso, tipo salvaje
La secreción de IL-1β es un sello distintivo de la activación de la inflamación.Para determinar si G. duodenalis alfa-2 giardina y alfa-7.3 giardina activan el inflamasoma del huésped NLRP3 in vivo, utilizamos ratones WT no tratados (grupo simulado) y ratones bloqueados con inflamasoma NLRP3 (grupo de tratamiento inhibido por MCC950).En la Fig. 4a se muestra un esquema detallado del experimento.Los grupos experimentales estaban formados por ratones tratados con PBS, tratamiento de quistes de G. duodenalis mediante sonda nasogástrica, inyección intramuscular de pcDNA3.1 e inyección intramuscular de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina.El séptimo día después de la administración intramuscular del plásmido recombinante, se recogió suero y se determinó el nivel de IL-1β en cada grupo.Como se muestra en la Figura 4b, en el grupo MOCK: (i) en comparación con el grupo PBS, el tratamiento con pcDNA3.1 no tuvo un efecto significativo sobre la secreción de IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), sin embargo, La secreción de IL-β estuvo significativamente elevada en el grupo de quistes de G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardina y pcDNA3.1- La inyección intramuscular de alfa-7.3 giardina aumentó significativamente los niveles séricos de IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina indujo altos niveles de secreción de IL-1β en el grupo de inyección intramuscular de pcDNA3.1-alfa-2 giardina (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .En comparación con cada grupo en el grupo de tratamiento con MCC950 y el grupo MOCK: (i) los niveles de secreción de IL-1β en el grupo de control de PBS y el grupo de control de pcDNA3.1 disminuyeron hasta cierto punto después de bloquear el inhibidor de MCC950, pero la diferencia no fue significativo (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) después de bloquear MCC950., la secreción de IL-1β se redujo significativamente en el grupo infectado con quistes de G. duodenalis, el grupo de giardina pcDNA3.1-alfa-2 y el grupo de giardina pcDNA3.1-alfa-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, P = 0,0164).Estos resultados sugieren que la alfa-2 giardina y la alfa-7.3 giardina median la activación del inflamasoma NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giaardinas activan el inflamasoma del huésped NLRP3 in vivo.Los ratones se inmunizaron (IM) con el plásmido de expresión eucariota recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina y luego se trataron con MCC950 (ip; grupo MCC950) o no (grupo ficticio). ).El grupo de tratamiento con plásmido PBS o pcDNA3.1(+) se usó como control negativo, el grupo de tratamiento con quiste de G. duodenalis se usó como control positivo.Grupo experimental y régimen de tratamiento.b Los niveles séricos de IL-1β en ratones se midieron el día 7 mediante un ensayo ELISA.Las diferencias entre los grupos del grupo MOCK se analizaron mediante ANOVA unidireccional, y las diferencias entre el grupo MOCK y el grupo MCC950 se analizaron mediante la prueba t del software SPSS versión 22.0.Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en el grupo MOCK, *P<0,05 y ***P<0,001;los signos de dólar ($) indican diferencias significativas entre cada grupo en el grupo MOCK y el grupo MCC950 en P<0,05.Resultados de siete experimentos biológicos independientes.i, inyección intramuscular, ns, no significativo (P > 0,05)
Para investigar el efecto de la activación mediada por giardina alfa-2 y alfa-7.3 del inflamasoma del huésped NLRP3 sobre la infectividad de G. duodenalis, utilizamos ratones WT C57BL/6 e inyectamos giardina alfa-2 y giardina alfa-7.3.el plásmido se inyectó por vía intramuscular, después de 3 días a través del tubo gástrico del quiste de G. duodenalis, tras lo cual los ratones fueron observados durante 7 días.En la Fig. 5a se muestra un esquema detallado del experimento.Se midió el peso corporal de cada ratón todos los días, se recogieron muestras de tejido duodenal fresco el séptimo día después de la administración a través de una sonda gástrica, se midió el número de trofozoítos y se observaron cambios histopatológicos.Como se muestra en la Figura 5b, al aumentar el tiempo de alimentación, el peso corporal de los ratones en cada grupo aumentó gradualmente.La MT de los ratones comenzó a disminuir el tercer día después de la administración intragástrica de quistes de G. duodenalis y luego aumentó gradualmente.La activación del inflamasoma NLRP3 inducida por la inyección intramuscular de alfa-2 giardina y alfa7.3 giardina atenuó significativamente la pérdida de peso en ratones (Día 1: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Día 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Día 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Día 2: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 Día 3: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Día 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Día 4: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Día 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Día 5: pcDNA3.1-alfa - 2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Día 5: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Día 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, día 6: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Día 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Día 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).La carga parasitaria se evaluó en el duodeno (Fig. 5c).En comparación con el control positivo no tratado y el grupo al que se le inyectó el vector pcDNA3.1 vacío, el número de trofozoítos de G. duodenalis se redujo significativamente en los grupos a los que se les inyectó α-2 giardina y α-7,3 giardina (pcDNA3.1-alfa). -2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Además, la giardina alfa-7.3 fue más protectora en ratones que la giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Los resultados de la tinción HE se muestran en la fig.5d–f.Los ratones inyectados con alfa-2 giardina y alfa-7.3 giardina tuvieron menos lesiones en el tejido duodenal, manifestadas por daño de las vellosidades, en comparación con los ratones inyectados con G. duodenalis y los ratones inyectados con G. duodenalis en combinación con un vector pcDNA3 vacío .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 o P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 o P = 0,0055) y atrofia reducida de las criptas (pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 o P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 o P = 0,0191).Estos resultados sugieren que la alfa-2 giardina y la alfa-7,3 giardina reducen la infectividad de G. duodenalis activando el inflamasoma NLRP3 in vivo.
Papel de pcDNA3.1 (+) -giardinas en la infección por G. duodenalis.Los ratones se inmunizaron (IM) con plásmidos de expresión eucariotas recombinantes pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina y luego se expusieron a quistes de G. duodenalis (ig).El grupo de PBS y el grupo de tratamiento de quiste duodenal pcDNA3.1(+) + se utilizaron como grupos de control negativo, y el grupo de tratamiento de quiste duodenal se utilizó como grupo de control positivo.Grupo experimental y régimen de tratamiento.b La MT de los ratones en cada uno de los diversos grupos de tratamiento se controló durante 7 días después de la exposición.Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos del grupo G. duodenalis y el grupo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina, *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001;el signo de dólar ($) indica una diferencia significativa entre cada grupo de G. duodenalis y el grupo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine, $$P<0,01 y $$$P<0,001.c La carga parasitaria se determinó contando el número de trofozoítos en 1 ml de lavado duodenal del duodeno (3 cm de largo) y se expresó como el número de parásitos por cm de duodeno.Las diferencias entre el grupo de infección por G. duodenalis, el grupo de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina y el grupo de pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina se analizaron mediante ANOVA unidireccional utilizando el software SPSS versión 22.0.Los asteriscos indican diferencias significativas en **P<0,01 y ***P<0,001.d Cambios histopatológicos en el duodeno.Las flechas rojas indican daño a las vellosidades, las flechas verdes indican daño a las criptas.Barra de escala: 100 µm.e, f Análisis estadístico de la altura de las vellosidades duodenales del ratón (e) y la altura de la cripta (f).Las diferencias entre los grupos en la Figura 1d se analizaron mediante ANOVA unidireccional utilizando el software SPSS versión 22.0.Los asteriscos indican diferencias significativas en *P<0,05 y **P<0,01.Resultados de siete experimentos biológicos independientes.ns, no significativo (P > 0,05)
Giardia duodeno es un conocido parásito intestinal de humanos y otros mamíferos que causa giardiasis.En 2004, se incluyó en la Iniciativa de Enfermedades Desatendidas de la OMS debido a su alta prevalencia durante 6 años, especialmente en comunidades de bajo nivel socioeconómico [32].El sistema inmunológico innato desempeña un papel fundamental en la respuesta inmunitaria a la infección por G. duodenalis.Se ha informado que los macrófagos de ratón engullen y matan a G. duodenalis liberando trampas extracelulares [33].Nuestros estudios previos han demostrado que G. duodenalis, un parásito extracelular no invasivo, activa las vías de señalización inflamatoria p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 y NLRP3 en macrófagos de ratón para regular las respuestas inflamatorias del huésped, y el GEV liberado puede mejorar este proceso.13], 24].Sin embargo, aún no se han dilucidado los PAMP exactos implicados en la inflamación regulada por el inflamasoma NLRP3 en GEV y el papel del inflamasoma NLRP3 en la giardiasis.Para arrojar luz sobre estas dos preguntas, realizamos este estudio.
El inflamasoma NLRP3 se encuentra en el citoplasma de las células inmunitarias y puede ser activado por diversas partículas como cristales de ácido úrico, toxinas, bacterias, virus y parásitos.En estudios bacterianos, se han identificado toxinas como PAMP clave que activan sensores inflamatorios, lo que provoca inflamación y muerte celular [34].Algunas toxinas estructuralmente diversas, como la hemolisina de Staphylococcus aureus [35] y Escherichia coli [36], la hemolisina BL (HBL) de la enterotoxina (NHE) [37], inducen la activación de la inflamación NLRP3.Los estudios virales han demostrado que las proteínas de virulencia como la proteína de la envoltura (E) del SARS-COV-2 [38] y la proteína NS5 del virus del Zika [39] son ​​PAMP importantes reconocidas por el receptor NLRP3.En estudios de parásitos, se ha informado que muchos parásitos están asociados con la activación del inflamasoma del huésped, como Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] y Leishmania [42].Las proteínas granulares densas GRA35, GRA42 y GRA43, asociadas con la virulencia de Toxoplasma gondii, son necesarias para la inducción de piroptosis en macrófagos de rata Lewis [43].Además, algunos estudios de Leishmania se han centrado en moléculas individuales implicadas en el inflamasoma NLRP3, como el lipofosfoglicano de membrana del parásito [44] o la metaloproteasa de zinc [45].Entre la familia de genes alfa-giardina similares a las anexinas, se ha demostrado que la alfa-1 giardina es una posible vacuna candidata que brinda protección contra G. duodenalis en un modelo de ratón [18].En nuestro estudio, seleccionamos los factores de virulencia alfa-2 y alfa-7,3 giardinas de G. duodenalis, que son exclusivos de giardia pero relativamente menos reportados.Estos dos genes diana se clonaron en el vector del sistema de expresión eucariótico pcDNA3.1(+) para el análisis de la activación de la inflamación.
En nuestro modelo de ratón, los fragmentos de caspasa escindidos sirven como marcadores de activación inflamatoria.Tras la estimulación, NLRP3 interactúa con ASC, recluta procaspasas y genera caspasas activas que escinden pro-IL-1β y pro-IL-18 en IL-1β e IL-18 maduras, respectivamente -18.Las caspasas inflamatorias (caspasas-1, -4, -5 y -11) son una familia conservada de cisteína proteasas que son críticas para la defensa innata y están involucradas en la inflamación y la muerte celular programada [46].La caspasa-1 se activa mediante inflamasomas canónicos [47], mientras que las caspasas-4, -5 y -11 se escinden durante la formación de inflamasomas atípicos [48].En este estudio, utilizamos macrófagos peritoneales de ratón como modelo e investigamos la caspasa-1 escindida p20 caspasa-1 como marcador de la activación de la inflamación NLRP3 del huésped en estudios de infección por G. duodenalis.Los resultados mostraron que muchas alfa-giardinas son responsables de la activación típica de la inflamación, lo que concuerda con el descubrimiento de moléculas de virulencia clave involucradas en bacterias y virus.Sin embargo, nuestro estudio es sólo una prueba preliminar y existen otras moléculas que pueden activar inflamasomas no clásicos, ya que nuestro estudio anterior encontró inflamasomas tanto clásicos como no clásicos en la infección por G. duodenalis [13].Para determinar aún más si la caspasa-1 p20 generada está asociada con el inflamasoma NLRP3, transfectamos giardinas alfa-2 y alfa-7.3 en macrófagos peritoneales de ratón para determinar los niveles de expresión de proteínas de moléculas clave y los niveles de oligomerización de ASC, confirmando que ambas α-giardinas se activan. inflamasoma NLRP3.Nuestros resultados son ligeramente diferentes de los de Manko-Prykhoda et al., quienes informaron que la estimulación de células Caco-2 con cepas EPEC de G. muris o E. coli solas puede aumentar la intensidad de fluorescencia de NLRP3, ASC y caspasa-1. aunque no de manera significativa, mientras que la coestimulación de G. muris y E. coli aumentó los niveles de tres proteínas [49].Esta discrepancia puede deberse a diferencias en la selección de especies, líneas celulares y células primarias de Giardia.También realizamos ensayos in vivo utilizando MCC950 en ratones hembra WT C57BL/6 de 5 semanas de edad, que son más susceptibles a G. duodenalis.MCC950 es un inhibidor de NLRP3 de molécula pequeña potente y selectivo que bloquea la activación de NLRP3 canónica y no canónica en concentraciones nanomolares.MCC950 inhibe la activación de NLRP3 pero no afecta la activación de las vías inflamatorias AIM2, NLRC4 y NLRP1 o las vías de señalización de TLR [27].MCC950 bloquea la activación de NLRP3 pero no inhibe el inicio de NLRP3, la salida de K+, la entrada de Ca2+ ni la interacción entre NLRP3 y ASC;en cambio, inhibe la activación del inflamasoma NLRP3 al bloquear la oligomerización de ASC [27].Por lo tanto, utilizamos MCC950 en un estudio in vivo para determinar el papel del inflamasoma NLRP3 después de la inyección de giardina.La caspasa-1 p10 activada escinde las citocinas proinflamatorias pro-IL-1β y pro-IL-18 en IL-1β e IL-18 maduras [50].En este estudio, los niveles séricos de IL-1β en ratones tratados con giardina con o sin MCC950 se utilizaron como indicador de si el inflamasoma NLRP3 estaba activado.Como se esperaba, el tratamiento con MCC950 redujo significativamente los niveles séricos de IL-1β.Estos datos demuestran claramente que G. duodenalis giardin alfa-2 y giardin alfa-7.3 son capaces de activar el inflamasoma de ratón NLRP3.
Datos importantes acumulados durante la última década han demostrado que la IL-17A es el principal regulador de la inmunidad contra G. muris, induciendo la señalización de IL-17RA, produciendo péptidos antimicrobianos y regulando la activación del complemento [51].Sin embargo, la infección por Giardia ocurre con mayor frecuencia en adultos jóvenes y se ha informado que la infección por Giardia en ratones jóvenes no activa la respuesta de IL-17A para ejercer su efecto protector [52], lo que llevó a los investigadores a buscar otras Giardia inmunomoduladoras.Mecanismos de infección por helmintos.Los autores de un estudio reciente informaron que G. muris puede activar el inflamasoma NLRP3 de E. coli EPEC, lo que promueve la producción de péptidos antimicrobianos y reduce su capacidad de unión y la cantidad de trofozoítos en el tracto intestinal, reduciendo así la gravedad del colon. enfermedades causadas por bacilos [49].El inflamasoma NLRP3 interviene en el desarrollo de diversas enfermedades.Los estudios han demostrado que Pseudomonas aeruginosa desencadena la autofagia en los macrófagos para evitar la muerte celular, y este proceso depende de la activación del inflamasoma NLRP3 [53].Para N. caninum, la activación del inflamasoma NLRP3 mediada por especies reactivas de oxígeno limita su replicación en el huésped, lo que lo convierte en un objetivo terapéutico potencial [9].Se ha descubierto que Paracoccidioides brasiliensis induce la activación del inflamasoma NLRP3 en células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratón, lo que da como resultado la liberación de la citocina inflamatoria IL-1β, que desempeña un papel fundamental en la defensa del huésped [10].Varias especies de Leishmania, incluidas L. amazonensis, L. major, L. braziliensis y L. infantum chagasi, activan NLRP3 y la caspasa-1 dependiente de ASC en macrófagos, así como la infección por Leishmania.La replicación del parásito aumenta en ratones deficientes en el gen NLRP3/ASC/caspasa-1 [11].Zamboni et al.Se ha informado que la infección por Leishmania induce la activación del inflamasoma NLRP3 en los macrófagos, lo que limita la replicación intracelular del parásito.Por tanto, Leishmania puede inhibir la activación de NLRP3 como estrategia de evitación.En estudios in vivo, el inflamasoma NLRP3 contribuyó a la eliminación de Leishmania, pero no afectó a los tejidos [54].Por el contrario, en estudios de helmintiasis, la activación del inflamasoma NLRP3 suprimió la inmunidad protectora del huésped contra la helmintiasis gastrointestinal [12].Shigella es una de las principales bacterias causantes de diarrea en todo el mundo.Estas bacterias pueden inducir la producción de IL-1β a través del eflujo de K+ mediado por el receptor P2X7, especies reactivas de oxígeno, acidificación lisosomal y daño mitocondrial.El inflamasoma NLRP3 regula negativamente la fagocitosis y la actividad bactericida de los macrófagos contra Shigella [55].Los estudios de Plasmodium han demostrado que los ratones con deficiencia de AIM2, NLRP3 o caspasa-1 infectados con Plasmodium producen altos niveles de interferón tipo 1 y son más resistentes a la infección por Plasmodium [56].Sin embargo, no está claro el papel de la alfa-2 giardina y la alfa-7.3 giardina en la inducción de la activación patógena de la inflamación NLRP3 en ratones.
En este estudio, la inhibición del inflamasoma NLRP3 por MCC950 redujo el peso corporal y aumentó la cantidad de trofozoítos en el líquido del lavado intestinal en ratones, lo que resultó en cambios patológicos más graves en el tejido duodenal.La giardina alfa-2 y la giardina alfa-7.3 activan el inflamasoma NLRP3 del ratón huésped, aumentan el peso corporal del ratón, reducen la cantidad de trofozoítos en el líquido de lavado intestinal y alivian las lesiones duodenales patológicas.Estos resultados sugieren que G. duodenalis puede activar el inflamasoma del huésped NLRP3 a través de alfa-2 giardina y alfa-7,3 giardina, reduciendo la patogenicidad de G. duodenalis en ratones.
En conjunto, nuestros resultados demuestran que las giardinas alfa-2 y alfa-7.3 inducen la activación del inflamasoma del huésped NLRP3 y reducen la infectividad de G. duodenalis en ratones.Por tanto, estas moléculas son objetivos prometedores para la prevención de la giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
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