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Toxoplasma gondii es un parásito protozoario intracelular que modula el microambiente del huésped infectado y se sabe que está asociado con la incidencia de crecimiento de tumores cerebrales.En este estudio, planteamos la hipótesis de que el miARN-21 exosómico de la infección por Toxoplasma promueve el crecimiento de tumores cerebrales.Se caracterizaron exosomas de microglía BV2 infectada con Toxoplasma y se confirmó la internalización de células de glioma U87.Los perfiles de expresión de microARN exosómicos se analizaron utilizando matrices de microARN y microARN-21A-5p asociados con Toxoplasma gondii y clasificación de tumores.También investigamos los niveles de ARNm de genes asociados a tumores en células de glioma U87 alterando los niveles de miR-21 en exosomas y el efecto de los exosomas en la proliferación de células de glioma U87 humano.En exosomas de células de glioma U87 infectadas con Toxoplasma gondii, la expresión de microARN-21 aumenta y la actividad de genes antitumorales (FoxO1, PTEN y PDCD4) se reduce.Los exosomas derivados de BV2 infectados con Toxoplasma inducen la proliferación de células de glioma U87.Los exosomas inducen el crecimiento de células U87 en un modelo de tumor de ratón.Sugerimos que el aumento de miR-21 exosomal en la microglía BV2 infectada con Toxoplasma puede desempeñar un papel importante como promotor del crecimiento celular en las células de glioma U87 mediante la regulación negativa de los genes antitumorales.
Se estima que en 2018 se diagnosticaron más de 18,1 millones de casos de cáncer avanzado en todo el mundo, con alrededor de 297 000 tumores del sistema nervioso central diagnosticados cada año (1,6 % de todos los tumores)1.Investigaciones anteriores han demostrado que los factores de riesgo para desarrollar tumores cerebrales humanos incluyen varios productos químicos, antecedentes familiares y radiación ionizante de equipos terapéuticos y de diagnóstico para la cabeza.Sin embargo, se desconoce la causa exacta de estos tumores malignos.Aproximadamente el 20% de todos los cánceres en el mundo son causados ​​por agentes infecciosos, incluidos virus, bacterias y parásitos3,4.Los patógenos infecciosos interrumpen los mecanismos genéticos de la célula huésped, como la reparación del ADN y el ciclo celular, y pueden provocar inflamación crónica y daños en el sistema inmunitario5.
Los agentes infecciosos asociados con el cáncer humano son los patógenos virales más comunes, incluidos los virus del papiloma humano y los virus de la hepatitis B y C.Los parásitos también pueden desempeñar un papel potencial en el desarrollo del cáncer humano.Varias especies de parásitos, a saber, Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis e Hymenolepis nana, se han implicado en varios tipos de cáncer humano 6,7,8.
Toxoplasma gondii es un protozoo intracelular que regula el microambiente de las células huésped infectadas.Se estima que este parásito infecta aproximadamente al 30% de la población mundial, poniendo en riesgo a toda la población9,10.El Toxoplasma gondii puede infectar órganos vitales, incluido el sistema nervioso central (SNC), y causar enfermedades graves como meningitis y encefalitis mortales, especialmente en pacientes inmunocomprometidos9.Sin embargo, Toxoplasma gondii también puede alterar el entorno del huésped infectado al modular el crecimiento celular y las respuestas inmunitarias en individuos inmunocompetentes, lo que conduce al mantenimiento de una infección crónica asintomática9,11.Curiosamente, dada la correlación entre la prevalencia de T. gondii y la incidencia de tumores cerebrales, algunos informes sugieren que los cambios ambientales in vivo del huésped debido a la infección crónica por T. gondii se asemejan al microambiente tumoral.
Los exosomas se conocen como comunicadores intercelulares que entregan contenido biológico, incluidas proteínas y ácidos nucleicos, de las células vecinas16,17.Los exosomas pueden influir en los procesos biológicos relacionados con el tumor, como la antiapoptosis, la angiogénesis y la metástasis en el microambiente tumoral.En particular, los miARN (miARN), pequeños ARN no codificantes de unos 22 nucleótidos de longitud, son importantes reguladores de genes postranscripcionales que controlan más del 30 % del ARNm humano a través del complejo de silenciamiento inducido por miARN (miRISC).Toxoplasma gondii puede alterar los procesos biológicos al controlar la expresión de miARN en huéspedes infectados.Los miARN del huésped contienen señales importantes para regular los procesos biológicos del huésped a fin de lograr la estrategia de supervivencia del parásito.Por lo tanto, estudiar los cambios en el perfil de miARN del huésped tras la infección con T. gondii puede ayudarnos a comprender más claramente la interacción entre el huésped y T. gondii.De hecho, Thirugnanam et al.15 sugirieron que T. gondii promueve la carcinogénesis cerebral al alterar su expresión en miARN específicos del huésped asociados con el crecimiento tumoral y encontraron que T. gondii puede causar gliomas en animales de experimentación.
Este estudio se centra en la alteración de miR-21 exosomal en la microglía huésped infectada con Toxoplasma BV2.Observamos un posible papel de miR-21 exosomal alterado en el crecimiento de células de glioma U87 debido a la retención en el núcleo de FoxO1/p27, que es el objetivo de miR-21 sobreexpresado.
Los exosomas derivados de BV2 se obtuvieron mediante centrifugación diferencial y se validaron mediante varios métodos para evitar la contaminación con componentes celulares u otras vesículas.La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) mostró patrones distintos entre las proteínas extraídas de las células BV2 y los exosomas (Figura 1A), y se evaluó la presencia de Alix en las muestras, que se analizó mediante transferencia Western de marcadores de proteínas exosomales en .El marcaje de Alix se encontró en proteínas de exosomas pero no en proteínas de lisado de células BV2 (Fig. 1B).Además, se analizó el ARN purificado de exosomas derivados de BV2 utilizando un bioanalizador.Las subunidades ribosómicas 18S y 28S rara vez se observaron en el patrón de migración de ARN exosomal, lo que indica una pureza confiable (Figura 1C).Finalmente, la microscopía electrónica de transmisión mostró que los exosomas observados tenían un tamaño de aproximadamente 60 a 150 nm y tenían una estructura en forma de copa típica de la morfología del exosoma (Fig. 1D).
Caracterización de exosomas derivados de células BV2.(A) Página de ficha de datos de seguridad.Se aislaron proteínas de células BV2 o exosomas derivados de BV2.Los patrones de proteínas difieren entre las células y los exosomas.(B) Análisis de transferencia Western de un marcador exosómico (Alix).(C) Evaluación de ARN purificado de células BV2 y exosomas derivados de BV2 utilizando un bioanalizador.Por lo tanto, las subunidades ribosómicas 18S y 28S en las células BV2 rara vez se encontraron en el ARN exosómico.(D) La microscopía electrónica de transmisión mostró que los exosomas aislados de células BV2 se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 2 %.Los exosomas tienen un tamaño aproximado de 60 a 150 nm y tienen forma de copa (Song y Jung, datos no publicados).
La internalización celular de exosomas derivados de BV2 en células de glioma humano U87 se observó mediante microscopía confocal.Los exosomas marcados con PKH26 se localizan en el citoplasma de las células U87.Los núcleos se tiñeron con DAPI (Fig. 2A), lo que indica que las células huésped pueden internalizar los exosomas derivados de BV2 e influir en el entorno de las células receptoras.
La internalización de exosomas derivados de BV2 en células de glioma U87 y exosomas derivados de BV2 infectados con Toxoplasma RH indujo la proliferación de células de glioma U87.(A) Exosomas engullidos por células U87 medidos por microscopía confocal.Las células de glioma U87 se incubaron con exosomas marcados con PKH26 (rojo) o sin control durante 24 horas.Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul) y luego se observaron bajo un microscopio confocal (barra de escala: 10 μm, x 3000).(B) La proliferación de células de glioma U87 se determinó mediante un ensayo de proliferación celular.Las células de glioma U87 se trataron con exosomas durante el tiempo indicado. *P < 0,05 se obtuvo mediante la prueba t de Student. *P < 0,05 se obtuvo mediante la prueba t de Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 según la prueba t de Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtenido mediante la prueba t de Student.
Después de confirmar la internalización de exosomas derivados de BV2 en células de glioma U87, realizamos ensayos de proliferación celular para investigar el papel de los exosomas derivados de toxoplasma derivados de BV2 en el desarrollo de células de glioma humano.El tratamiento de células U87 con exosomas de células BV2 infectadas con T. gondii mostró que los exosomas derivados de BV2 infectados con T. gondii causaron una proliferación significativamente mayor de células U87 en comparación con el control (Fig. 2B).
Además, el crecimiento de células U118 tuvo los mismos resultados que U87, ya que los exosomas estimulados por Toxoplasma causaron los niveles más altos de proliferación (datos no mostrados).Con base en estos datos, podemos indicar que los exosomas infectados con Toxoplasma derivados de BV2 juegan un papel importante en la proliferación de células de glioma.
Para investigar el efecto de los exosomas derivados de BV2 infectados con toxoplasma en el desarrollo del tumor, inyectamos células de glioma U87 en ratones desnudos para un modelo de xenoinjerto e inyectamos exosomas derivados de BV2 o exosomas derivados de BV2 infectados con RH.Después de que los tumores se hicieran evidentes después de 1 semana, cada grupo experimental de 5 ratones se dividió según el tamaño del tumor para determinar el mismo punto de partida y se midió el tamaño del tumor durante 22 días.
En ratones con el modelo de xenoinjerto U87, se observaron un tamaño y un peso del tumor significativamente mayores en el grupo de exosomas infectados con RH derivados de BV2 en el día 22 (Fig. 3A, B).Por otro lado, no hubo una diferencia significativa en el tamaño del tumor entre el grupo de exosomas derivados de BV2 y el grupo de control después del tratamiento con exosomas.Además, los ratones inyectados con células de glioma y exosomas mostraron visualmente el volumen tumoral más grande en el grupo de exosomas derivados de BV2 infectados con RH (Fig. 3C).Estos resultados demuestran que los exosomas infectados con Toxoplasma derivados de BV2 inducen el crecimiento de gliomas en un modelo de tumor de ratón.
Oncogénesis (AC) de exosomas derivados de BV2 en un modelo de ratón con xenoinjerto U87.El tamaño del tumor (A) y el peso (B) aumentaron significativamente en ratones desnudos BALB/c tratados con exosomas infectados con RH derivados de BV2.A ratones desnudos BALB/c (C) se les inyectó por vía subcutánea 1 x 107 células U87 suspendidas en una mezcla de Matrigel.Seis días después de la inyección, se trataron 100 μg de exosomas derivados de BV2 en ratones.El tamaño y el peso del tumor se midieron en los días indicados y después del sacrificio, respectivamente. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0.05。 *P < 0.05。 *Р < 0,05. *P < 0,05.
Los datos mostraron que 37 miARN (16 sobreexpresados ​​y 21 infraexpresados) asociados con la inmunidad o el desarrollo de tumores se alteraron significativamente en la microglía después de la infección con la cepa Toxoplasma RH (Fig. 4A).Los niveles de expresión relativos de miR-21 entre los miARN alterados se confirmaron mediante RT-PCR en tiempo real en exosomas derivados de BV2, exosomas tratados con células BV2 y U87.La expresión de miR-21 mostró un aumento significativo en los exosomas de las células BV2 infectadas con Toxoplasma gondii (cepa RH) (Fig. 4B).Los niveles de expresión relativos de miR-21 en células BV2 y U87 aumentaron después de la absorción de exosomas alterados (Fig. 4B).Los niveles relativos de expresión de miR-21 en los tejidos cerebrales de pacientes con tumores y ratones infectados con Toxoplasma gondii (cepa ME49) fueron más altos que en los controles, respectivamente (Fig. 4C).Estos resultados se correlacionan con las diferencias entre los niveles de expresión de los microARN predichos y confirmados in vitro e in vivo.
Cambios en la expresión de miP-21a-5p exosomal en microglia infectada con Toxoplasma gondii (RH).(A) Demuestra cambios significativos en el siRNA asociados con la inmunidad o el desarrollo de tumores después de la infección por T. gondii RH.(B) Los niveles de expresión relativos de miR-21 se detectaron mediante RT-PCR en tiempo real en exosomas derivados de BV2, exosomas tratados con BV2 y células U87.(C) Se encontraron niveles de expresión relativos de miR-21 en los tejidos cerebrales de pacientes con tumores (N=3) y ratones infectados con Toxoplasma gondii (cepa ME49) (N=3). *P < 0,05 se obtuvo mediante la prueba t de Student. *P < 0,05 se obtuvo mediante la prueba t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 se obtuvo utilizando la prueba t de Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtenido mediante la prueba t de Student.
Los exosomas de células BV2 infectadas con RH condujeron al crecimiento de gliomas in vivo e in vitro (Fig. 2, 3).Para detectar ARNm relevantes, examinamos los niveles de ARNm de genes diana antitumorales, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN y muerte celular programada 4 (PDCD4) en células U87 infectadas con exosomas derivados de BV2 o RH BV2.El análisis bioinformático ha demostrado que varios genes asociados a tumores, incluidos los genes FoxO1, PTEN y PDCD4, tienen sitios de unión miR-2121,22.Los niveles de ARNm de los genes diana antitumorales se redujeron en los exosomas derivados de BV2 infectados con RH en comparación con los exosomas derivados de BV2 (Fig. 5A).FoxO1 mostró niveles reducidos de proteína en exosomas derivados de BV2 infectados con RH en comparación con exosomas derivados de BV2 (Figura 5B).En base a estos resultados, pudimos confirmar que los exosomas derivados de BV2 infectados con RH regulan a la baja los genes antioncogénicos, manteniendo su papel en el crecimiento tumoral.
Los exosomas derivados de BV2 infectados con Toxoplasma RH inducen la supresión de genes antitumorales en células de glioma U87 por exosomas derivados de BV2 infectados con Toxoplasma RH.(A) PCR en tiempo real de la expresión de FoxO1, PTEN y PDCD4 en exosomas derivados de BV2 infectado con RH de T. gondii en comparación con exosomas de PBS.Se usó ARNm de β-actina como control.(B) La expresión de FoxO1 se determinó mediante transferencia Western y los datos de densitometría se evaluaron estadísticamente mediante el programa ImageJ. *P < 0,05 se obtuvo mediante la prueba t de Student. *P < 0,05 se obtuvo mediante la prueba t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 se obtuvo utilizando la prueba t de Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtenido mediante la prueba t de Student.
Para comprender el efecto de miP-21 en exosomas sobre la regulación génica asociada a tumores, se transfectaron células U87 con un inhibidor de miP-21 usando Lipofectamine 2000 y las células se recolectaron 24 horas después de la transfección.Los niveles de expresión de FoxO1 y p27 en células transfectadas con inhibidores de miR-21 se compararon con células tratadas con exosomas derivados de BV2 usando qRT-PCR (Fig. 6A, B).La transfección del inhibidor de miR-21 en células U87 regulaba significativamente a la baja la expresión de FoxO1 y p27 (FIG. 6).
MiP-21 exosomal derivado de BV2 infectado con RH alteró la expresión de FoxO1/p27 en células de glioma U87.Las células U87 se transfectaron con el inhibidor de miP-21 usando Lipofectamine 2000 y las células se recolectaron 24 horas después de la transfección.Los niveles de expresión de FoxO1 y p27 en células transfectadas con inhibidores de miR-21 se compararon con los niveles en células tratadas con exosomas derivados de BV2 usando qRT-PCR (A, B).
Para escapar de la respuesta inmune del huésped, el parásito Toxoplasma se transforma en un quiste tisular.Parasitan varios tejidos, incluidos el cerebro, el corazón y el músculo esquelético, a lo largo de la vida del huésped y modulan la respuesta inmunitaria del huésped.Además, pueden regular el ciclo celular y la apoptosis de las células huésped, favoreciendo su proliferación14,24.Toxoplasma gondii infecta predominantemente las células dendríticas del huésped, los neutrófilos y el linaje de monocitos/macrófagos, incluida la microglía cerebral.Toxoplasma gondii induce la diferenciación de macrófagos del fenotipo M2, afecta la cicatrización de heridas después de la infección por patógenos y también se asocia con hipervascularización y fibrosis granulomatosa.Esta patogenia conductual de la infección por Toxoplasma puede estar relacionada con marcadores asociados con el desarrollo tumoral.El ambiente hostil regulado por Toxoplasma puede parecerse al precáncer correspondiente.Por lo tanto, se puede suponer que la infección por Toxoplasma debería contribuir al desarrollo de tumores cerebrales.De hecho, se han informado altas tasas de infección por Toxoplasma en el suero de pacientes con varios tumores cerebrales.Además, Toxoplasma gondii puede ser otro efector cancerígeno y actuar sinérgicamente para ayudar a otros carcinógenos infecciosos a desarrollar tumores cerebrales.En este sentido, vale la pena señalar que P. falciparum y el virus de Epstein-Barr contribuyen sinérgicamente a la formación del linfoma de Burkitt.
El papel de los exosomas como reguladores en el campo de la investigación del cáncer ha sido ampliamente investigado.Sin embargo, el papel de los exosomas entre los parásitos y los huéspedes infectados sigue sin comprenderse bien.Hasta ahora, varios reguladores, incluidas las proteínas secretadas, han explicado los procesos biológicos mediante los cuales los parásitos protozoarios resisten el ataque del huésped y perpetúan la infección.Recientemente, ha surgido un concepto cada vez mayor de que las microvesículas asociadas a protozoos y sus microARN interactúan con las células huésped para crear un entorno favorable para su supervivencia.Por lo tanto, se necesitan más estudios para descubrir la relación entre los miARN exosomales alterados y la proliferación de células de glioma.La alteración de microARN (grupo de genes miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 y miR-17-92) se une al promotor STAT3 en macrófagos humanos infectados con toxoplasma, se regula e induce anti -apoptosis en respuesta a la infección por Toxoplasma gondii 29 .La infección por toxoplasma aumenta la expresión de miR-17-5p y miR-106b-5p, que están asociados con varias enfermedades hiperproliferativas 30 .Estos datos sugieren que los miARN del huésped regulados por la infección por Toxoplasma son moléculas importantes para la supervivencia del parásito y la patogénesis en el comportamiento biológico del huésped.
Los miARN alterados pueden influir en varios tipos de comportamiento durante el inicio y la progresión de las células malignas, incluidos los gliomas: autosuficiencia de las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales inhibidoras del crecimiento, evasión de la apoptosis, potencial replicativo ilimitado, angiogénesis, invasión y metástasis e inflamación.En el glioma, se han identificado miARN alterados en varios estudios de perfiles de expresión.
En el presente estudio, confirmamos altos niveles de expresión de miRNA-21 en células huésped infectadas con toxoplasma.miR-21 se ha identificado como uno de los microARN sobreexpresados ​​con mayor frecuencia en tumores sólidos, incluidos los gliomas, 33 y su expresión se correlaciona con el grado de glioma.La evidencia acumulada sugiere que miR-21 es un nuevo oncogén que actúa como un factor antiapoptótico en el crecimiento del glioma y se sobreexpresa en gran medida en los tejidos y el plasma de las neoplasias malignas del cerebro humano.Curiosamente, la inactivación de miR-21 en células y tejidos de glioma desencadena la inhibición de la proliferación celular debido a la apoptosis dependiente de caspasa.El análisis bioinformático de los objetivos predichos de miR-21 reveló múltiples genes supresores de tumores asociados con las vías de apoptosis, incluida la muerte celular programada 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN y forkhead box O1 (FoxO1), con el sitio de unión miR-2121..22.38.
FoxO1, como uno de los factores de transcripción (FoxO), está involucrado en el desarrollo de varios tipos de cáncer humano y puede regular la expresión de genes supresores de tumores como p21, p27, Bim y FasL40.FoxO1 puede unirse y activar inhibidores del ciclo celular como p27 para suprimir el crecimiento celular.Además, FoxO1 es un efector clave de la señalización de PI3K/Akt y regula muchos procesos biológicos, como la progresión del ciclo celular y la diferenciación celular mediante la activación de la transcripción de p2742.
En conclusión, creemos que el miR-21 exosomal derivado de la microglía infectada con Toxoplasma puede desempeñar un papel importante como regulador del crecimiento de las células de glioma (Fig. 7).Sin embargo, se necesitan más estudios para encontrar un vínculo directo entre el miR-21 exosomal, la infección alterada por Toxoplasma y el crecimiento del glioma.Se espera que estos resultados proporcionen un punto de partida para estudiar la relación entre la infección por Toxoplasma y la incidencia de glioma.
En este estudio se propone un diagrama esquemático del mecanismo de carcinogénesis del glioma (cerebro).El autor dibuja en PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Todos los protocolos experimentales en este estudio, incluido el uso de animales, cumplieron con las Pautas éticas estándar del Comité de Usuarios y Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de Seúl y fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl (IRB número SNU- 150715).-2).Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de ARRIVE.
La microglía de ratón BV2 y las células de glioma humano U87 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Welgene, Seúl, Corea) y medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), respectivamente, cada uno con un contenido de suero bovino fetal al 10 %, l-4 mM. glutamina, penicilina 0,2 mM y estreptomicina 0,05 mM.Las células se cultivaron en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C.Se usó otra línea celular de glioma, U118, para comparación con las células U87.
Para aislar los exosomas de las cepas RH y ME49 infectadas con T. gondii, se recolectaron taquizoítos de T. gondii (cepa RH) de la cavidad abdominal de ratones BALB/c de 6 semanas de edad inyectados 3-4 días antes.Los taquizoítos se lavaron tres veces con PBS y se purificaron por centrifugación en Percoll al 40 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.)43.Para obtener taquizoitos de la cepa ME49, se inyectaron intraperitonealmente 20 quistes de tejido a ratones BALB/c y se recogió la transformación de taquizoitos en quistes lavando la cavidad abdominal en el día 6-8 después de la infección (PI).Ratones infectados con PBS.Los taquizoítos ME49 se cultivaron en células suplementadas con 100 μg/ml de penicilina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, EE. UU.), 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco/BRL) y suero bovino fetal al 5 % (Lonza, Walkersville, MD) .., EE. UU.) a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono.Después del cultivo en células Vero, los taquizoítos ME49 se pasaron dos veces a través de una aguja de calibre 25 y luego a través de un filtro de 5 µm para eliminar los desechos y las células.Después del lavado, los taquizoítos se resuspendieron en PBS44.Se mantuvieron quistes de tejido de Toxoplasma gondii cepa ME49 mediante inyección intraperitoneal de quistes aislados del cerebro de ratones C57BL/6 infectados (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Corea).Los cerebros de ratones infectados con ME49 se recogieron después de 3 meses de PI y se trituraron bajo un microscopio para aislar los quistes.Los ratones infectados se mantuvieron en condiciones especiales libres de patógenos (SPF) en la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl.
El ARN total se extrajo de exosomas derivados de BV2, células BV2 y tejidos utilizando el mini kit miRNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluido el tiempo de incubación para el paso de elución.La concentración de ARN se determinó en un espectrofotómetro NanoDrop 2000.La calidad de los microarrays de ARN se evaluó utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Países Bajos).
Se preparó DMEM con FBS pobre en exosomas al 10 % mediante ultracentrifugación a 100 000 g durante 16 horas a 4 °C y se filtró a través de un filtro de 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, EE. UU.).Se cultivaron células BV2, 5 × 105, en DMEM que contenía 10 % de FBS sin exosomas y 1 % de antibióticos a 37 °C y 5 % de CO2.Después de 24 horas de incubación, se añadieron taquizoítos de la cepa RH o ME49 (MOI = 10) a las células y los parásitos no invasores se eliminaron en una hora y se rellenaron con DMEM.Los exosomas de las células BV2 se aislaron mediante centrifugación diferencial modificada, el método más utilizado.Vuelva a suspender el sedimento de exosomas en 300 l de PBS para el análisis de proteínas o ARN.La concentración de exosomas aislados se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) y un espectrofotómetro NanoDrop 2000.
Los precipitados de células BV2 o exosomas derivados de BV2 se lisaron en solución de extracción de proteínas PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Corea) y las proteínas se cargaron en geles de poliacrilamida SDS al 10 % teñidos con azul brillante de Coomassie.Además, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF durante 2 horas.Las transferencias Western se validaron utilizando el anticuerpo Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.) como marcador exosómico.Se usaron IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EE. UU.) y un analizador de imágenes luminiscentes LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokio, Japón) como anticuerpo secundario..Se realizó microscopía electrónica de transmisión para estudiar el tamaño y la morfología de los exosomas.Los exosomas aislados de células BV2 (6,40 µg/µl) se prepararon en mallas recubiertas de carbono y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 2 % durante 1 min.Las muestras preparadas se observaron a un voltaje de aceleración de 80 kV utilizando un JEOL 1200-EX II (Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, EE. UU.).
Los exosomas derivados de BV2 se tiñeron con el kit PKH26 Red Fluorescent Linker (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 15 minutos a temperatura ambiente.Células U87, 2x105, con exosomas marcados con PKH26 (rojo) o sin exosomas como control negativo, se incubaron a 37 °C durante 24 horas en una incubadora con CO2 al 5 %.Los núcleos de las células U87 se tiñeron con DAPI (azul), las células U87 se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 15 min a 4 °C y luego se analizaron en un sistema de microscopio confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania).observable.
El cDNA se sintetizó a partir de siRNA utilizando la síntesis de la primera cadena de siRNA Mir-X y el kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japón).La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con el sistema de detección de PCR en tiempo real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) usando cebadores y plantillas mezclados con SYBR Premix.El ADN se amplificó durante 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 sy hibridación a 60 °C durante 60 s.Los datos de cada reacción de PCR se analizaron utilizando el módulo de análisis de datos del software del sistema óptico iQ™5 (Bio-Rad).Los cambios relativos en la expresión génica entre genes diana seleccionados y β-actina/ARNip (y U6) se calcularon utilizando el método de la curva estándar.Las secuencias de cebadores utilizadas se muestran en la Tabla 1.
Se sembraron 3 x 104 células de glioma U87 en placas de 96 pocillos y se mezclaron con exosomas infectados con Toxoplasma derivados de BV2 (50 μg/mL) o exosomas sin pulso derivados de BV2 (50 μg/mL) como controles a las 12, 18 y 36 horas .La tasa de proliferación celular se determinó utilizando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) (Figuras complementarias S1-S3) 46 .
Se compraron ratones desnudos BALB/c hembra de 5 semanas de edad de Orient Bio (Seongnam-si, Corea del Sur) y se mantuvieron individualmente en jaulas estériles a temperatura ambiente (22 ± 2 °C) y humedad (45 ± 15 °C).%) a temperatura ambiente (22±2°C) y humedad (45±15%).Se realizó un ciclo de luz de 12 horas y un ciclo de oscuridad de 12 horas bajo SPF (Centro Animal de la Escuela de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl).Los ratones se dividieron al azar en tres grupos de 5 ratones cada uno y a todos los grupos se les inyectó por vía subcutánea 400 ml de PBS que contenía 1 x 107 células de glioma U87 y factor de crecimiento reducido BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, EE. UU.).Seis días después de la inyección del tumor, se inyectaron 200 mg de exosomas derivados de células BV2 (con/sin infección por Toxoplasma) en el sitio del tumor.Veintidós días después de la infección del tumor, se midió el tamaño del tumor de los ratones de cada grupo con un calibrador tres veces por semana y se calculó el volumen del tumor mediante la fórmula: 0,5 × (ancho) × 2 × largo.
Análisis de expresión de microARN utilizando miRCURYTM LNA miRNA array, séptima generación has, mmu y rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Dinamarca) que cubren 1119 ratones bien caracterizados entre 3100 sondas de captura de miARN humano, de ratón y de rata.Durante este procedimiento, se eliminaron de 250 a 1000 ng de ARN total del 5'-fosfato mediante tratamiento con fosfatasa alcalina intestinal de ternera seguido de marcaje con colorante fluorescente verde Hy3.Luego, las muestras marcadas se hibridaron cargando portaobjetos de microarrays utilizando un kit de cámara de hibridación (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) y un kit de portaobjetos de hibridación (Agilent Technologies).La hibridación se llevó a cabo durante 16 horas a 56°C, luego los microarrays se lavaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.Los portaobjetos de microarrays procesados ​​se escanearon luego usando un sistema de escáner de microarrays Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Las imágenes escaneadas se importaron con el software Agilent Feature Extraction versión 10.7.3.1 (Agilent Technologies) y la intensidad de fluorescencia de cada imagen se cuantificó con el archivo GAL correspondiente del protocolo Exiqon modificado.Los datos de micromatrices para el estudio actual están depositados en la base de datos GEO con el número de acceso GPL32397.
Los perfiles de expresión de miARN exosómicos maduros en microglía de cepas RH o ME49 infectadas con Toxoplasma se analizaron utilizando varias herramientas de red.Los miARN asociados con el desarrollo de tumores se identificaron mediante miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) y se filtraron con una intensidad de señal normalizada (log2) superior a 8,0.Entre los miARN, se encontró que los miARN expresados ​​diferencialmente estaban más de 1,5 veces alterados mediante análisis de filtro de miARN alterados por cepas RH o ME49 infectadas con T. gondii.
Las células se sembraron en placas de seis pocillos (3 x 105 células/pocillo) en opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.).Las células transfectadas se cultivaron durante 6 horas y luego se cambió el medio a medio completo nuevo.Las células se recogieron 24 horas después de la transfección.
El análisis estadístico se realizó principalmente mediante la prueba t de Student con el software Excel (Microsoft, Washington, DC, EE. UU.).Para el análisis de animales experimentales, se realizó un ANOVA de dos vías utilizando el software Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. P < 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Todos los protocolos experimentales utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl (IRB número SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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